楊樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌P22、S16對(duì)近緣種植物生根和生長(zhǎng)的影響1)

韓志校 張澤坤 董 研 楊敏生 Dietrich Ewald

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定，071000) (德國(guó)聯(lián)邦林業(yè)及林產(chǎn)品研究中心林木遺傳育種研究所)

楊樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌P22、S16對(duì)近緣種植物生根和生長(zhǎng)的影響1)

韓志校 張澤坤 董 研 楊敏生 Dietrich Ewald

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定，071000) (德國(guó)聯(lián)邦林業(yè)及林產(chǎn)品研究中心林木遺傳育種研究所)

以從白楊雜種741楊內(nèi)生菌中提取得到的菌株P(guān)22和S16為研究對(duì)象，通過(guò)16S rDNA分子檢測(cè)證明它們分別屬于類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillussp.)和寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonassp.)。研究了菌株P(guān)22和S16對(duì)促進(jìn)近緣種植物生根及生長(zhǎng)的能力。結(jié)果表明：菌株P(guān)22和S16對(duì)三倍體毛白楊組培苗、歐美楊107和旱柳硬枝插條生根和生長(zhǎng)促進(jìn)作用顯著。證明這2株菌株為植物促生菌，可能具有固氮和誘導(dǎo)產(chǎn)生植物激素的作用，菌株P(guān)22的促進(jìn)生長(zhǎng)能力更加顯著。

植物內(nèi)生細(xì)菌；16S rDNA；組培苗；硬枝扦插；生根生長(zhǎng)

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-117～121,125

We isolatedPaenibacillus(P22) andStenotrophomonas(S16) from Endophytic bacteria of the hybrid poplar 741. They respectively belonged toPaenibacillussp. andStenotrophomonassp. by 16S rDNA molecular detection. Then, we studied the ability of strains P22 and S16 for promoting rooting and growing on sibling species plants. P22 and S16 remarkably promoted rooting and growing of tissue culture seedlings of TriploidPopulustomentosaand hardwood cuttings ofPopulus×canadensis‘Neva’ andSalixmatsudana. Two strains were plant growth-promoting bacteria, and they might have the functions of nitrogen fixation and inducing generation of plant hormones. The capacity of promoting growth of P22 was more remarkable.

Keywords Endophytic bacteria; 16S rDNA; Micropropagated shoots; Hardwood cutting; Growth

植物內(nèi)生細(xì)菌區(qū)別于生長(zhǎng)在植物表面的細(xì)菌，分布于健康植物體內(nèi)，具豐富的種群多樣性，不會(huì)使宿主植物表現(xiàn)出明顯的感染癥狀。作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的組成部分，它們可能促進(jìn)了宿主植物的適應(yīng)性。隨著人們對(duì)于自然環(huán)境保護(hù)意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，它們的研究和應(yīng)用對(duì)于降低病蟲(chóng)害或惡劣環(huán)境對(duì)植物的危害以及在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和固氮作用等方面具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值[1-6]，為人們利用植物內(nèi)生細(xì)菌提供了新的思考方向，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展前景。近幾年，多種植物的內(nèi)生細(xì)菌被科研人員從不同的作物上分離出來(lái)，同時(shí)也深入研究了其分類(lèi)地位和生物學(xué)功能[7-8]?，F(xiàn)階段多數(shù)與內(nèi)生細(xì)菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)機(jī)制相關(guān)的研究主要包含3個(gè)方面的內(nèi)容:①生物固氮或植物激素等被內(nèi)生細(xì)菌利用從而直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)；②寄主植物產(chǎn)生的植物激素可以被植物內(nèi)生細(xì)菌誘導(dǎo)從而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)；③利用內(nèi)生菌的微生態(tài)調(diào)節(jié)作用改變不良環(huán)境對(duì)寄主植物的影響，以此減少植物的病害與蟲(chóng)害，進(jìn)而提高作物產(chǎn)量。

筆者對(duì)內(nèi)生細(xì)菌促進(jìn)植物生根和生長(zhǎng)的影響進(jìn)行研究，以從白楊雜種741楊中分離的2株內(nèi)生細(xì)菌菌株為材料，采用16S rDNA分子檢測(cè)對(duì)其分類(lèi)地位進(jìn)行鑒定，并探索其對(duì)3種三倍體毛白楊(Populustomentosa)、歐美楊107(Populus×canadensis‘Neva’)和旱柳(Salixmatsudana)生根和生長(zhǎng)的影響，揭示植物內(nèi)生細(xì)菌在植物組織培養(yǎng)和硬枝扦插插穗培養(yǎng)中的作用，對(duì)今后研制和開(kāi)發(fā)這2種菌株為微生物的菌肥提供了必要的科學(xué)依據(jù)與理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的試驗(yàn)材料為三倍體毛白楊組培苗和1年生歐美楊107、旱柳。供試的菌株為從白楊雜種741楊中分離得到的內(nèi)生菌P22和S16[9]。

1.2 菌株的分子鑒定

菌株的活化：取出在冰箱中-72 ℃保存的菌株，擱置于室溫使其融化，然后再將融化后的菌株用接種環(huán)取出一環(huán)劃于溫度為28 ℃、濕度85%的固體TSA肉湯培養(yǎng)基中活化12 h；并在相同的環(huán)境下繼續(xù)轉(zhuǎn)接活化的菌株，使其擴(kuò)增培養(yǎng)，以此使菌株達(dá)到最佳的活性狀態(tài)。

TSA固體培養(yǎng)基的配方：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，瓊脂粉15.0 g，并用去離子水定容至1 L，pH=7.4，121 ℃滅菌20 min。

16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增：將在TSA固體肉湯培養(yǎng)基平板上活化了的菌株，接種于TSA液體肉湯培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，收集菌體。DNA提取方法參照文獻(xiàn)[10]，并略作修改。PCR擴(kuò)增所用引物來(lái)自于大腸桿菌16S rDNA基因序列保守區(qū)域，正向引物P1(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，反向引物P6(5′-AAGGAGGTGWTCCARCC-3′)。PCR擴(kuò)增體系為10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L P1和P6各1 μL，DNA模板1 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.5 μL，補(bǔ)足ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)后于72 ℃保溫7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物片斷大小分別為1.5、1.0 kb。

16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)生分析：由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對(duì)菌株P(guān)22和S16的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。利用Blast程序?qū)τ蒔22和S16測(cè)序得到的兩種菌株的序列在GenBank中進(jìn)行相似序列對(duì)比，從中選取相似性較高的序列后利用Claustal X進(jìn)行相似序列對(duì)比分析，然后用MEGA軟件構(gòu)件系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行Bootstrap分析，并重復(fù)1 000次。

1.3 組培苗接菌培養(yǎng)

低氮培養(yǎng)基接菌處理：試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基為低氮BEMB200培養(yǎng)基[11](含有2.5 mmol/L硝酸銨)。分別向裝有40 mL珍珠巖的100 mL的錐形瓶中加入已配置好的培養(yǎng)基，一般以培養(yǎng)液浸透珍珠巖為宜。分裝完成后高溫高壓滅菌20 min。將選用的三倍體毛白楊組培苗置于超凈工作臺(tái)上，剪成莖段，每段至少帶有2個(gè)葉腋，長(zhǎng)約1.5 cm。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，CK(不接菌)、P22(接菌P22)、S16(接菌S16)。將切好的莖段在分別含有P22和S16培養(yǎng)過(guò)夜的TSA肉湯培養(yǎng)基中浸泡10 s，對(duì)照(CK)則不接菌。將處理好的莖段分別接入盛有低氮珍珠巖培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)。每個(gè)處理24瓶，每瓶接2個(gè)莖段。培養(yǎng)開(kāi)始后每10 d從各處理中隨機(jī)抽取8個(gè)組培苗調(diào)查主根數(shù)量、根長(zhǎng)和苗高、單株鮮質(zhì)量等，并觀察其健康狀況和生長(zhǎng)速度。培養(yǎng)30 d時(shí)，將組培苗取出，在烘箱中35 ℃恒質(zhì)量后[12]，測(cè)定苗的干質(zhì)量。

菌株與IBA聯(lián)合處理：將培養(yǎng)好的三倍體毛白楊組培材料如低氮培養(yǎng)基接菌處理方法蘸取S16和P22菌液后，分別接入不同IBA濃度的BEMB200珍珠巖培養(yǎng)基中，以IBA質(zhì)量濃度為0.15、0.30 mg/L為兩個(gè)處理。每個(gè)處理16瓶，每瓶接2個(gè)莖段。培養(yǎng)開(kāi)始后30 d時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查，其他調(diào)查方法同低氮培養(yǎng)基接菌處理。

1.4 硬枝插穗接菌扦插

插穗和插床準(zhǔn)備：2011年4月初，選擇歐美楊107和旱柳1年生的健壯無(wú)病蟲(chóng)害枝條，采用下斜剪、上斜剪的方法剪成插條，插條長(zhǎng)為10～12 cm，且?guī)в?～3個(gè)芽，插穗長(zhǎng)度以5～6 cm為宜，選擇長(zhǎng)度和粗度基本一致的50個(gè)插條為一捆。在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園進(jìn)行扦插育苗試驗(yàn)，試驗(yàn)地為壤土。選擇背風(fēng)向陽(yáng)的圃地做插床。插床要求地下深翻30 cm左右，用0.5%高錳酸鉀和50%多菌靈600倍液對(duì)土壤進(jìn)行消毒處理。

試驗(yàn)處理：采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方法，每個(gè)樹(shù)種有3個(gè)處理，分別為：S16(接菌株S16)、P22(接菌株P(guān)22)、CK。其中每個(gè)處理有3次重復(fù)，每次重復(fù)有20根插條。將培養(yǎng)好的菌液放在燒杯中，菌液深度約4 cm，然后將成捆的插條直立插入燒杯內(nèi)浸沾10 min，再取出來(lái)稍晾干即可。將處理好的插穗基部按一定的株行距插入事前用木棍打好的孔內(nèi)，埋土壓實(shí)浸透水，蒙罩塑料薄膜保濕。后期加強(qiáng)管理，適當(dāng)灌水。

觀察記錄：歐美楊107在扦插20、60、80 d時(shí)，旱柳在扦插20、40、60 d時(shí)，分別從每個(gè)處理3次重復(fù)的材料中隨機(jī)選取5個(gè)成活的插穗，觀察并記錄成活率，求出每處理生根的平均數(shù)量、平均長(zhǎng)度，稱(chēng)取生物量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用DPS軟件和Excel2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)22和S16的16S rDNA序列

對(duì)P22菌株的16S rDNA測(cè)序得到，其核苷酸序列大小約為1 501 bp。并在Genbank中與一些相似的序列作比較表明，菌株P(guān)22的核苷酸序列與一些菌株的序列相似性較高達(dá)到了99%，而與另外一些的相似性相對(duì)較低，達(dá)到了96%(表1)。選取類(lèi)芽孢桿菌屬的幾種菌株的16S rDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1A)。結(jié)果表明：P22與菌株P(guān). sp.La1(AM906090)和P. sp.Ma-2(AM906089)親緣關(guān)系最近。

對(duì)S16菌株的16S rDNA測(cè)序得到，其核苷酸序列大小約為1 000 bp，并在GenBank中與一些的相似序列相比較得到，菌株S16的核酸序列與其中11個(gè)菌株的相似度達(dá)到97%，并構(gòu)建菌株S16的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1B)。結(jié)果表明，菌株S16與Stenotrophomonassp.Fa6(登記號(hào)為AY131216)的親緣關(guān)系最近。

表1 菌株的相關(guān)信息

圖1 菌株P(guān)22和S16的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

對(duì)菌株P(guān)22和S16的形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2和表3。根據(jù)菌株P(guān)22和S16的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA核苷酸序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》將菌株P(guān)22鑒定為類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillussp.、菌株S16為寡養(yǎng)食單胞菌Stenotrophomonassp.。

表2 菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征及染色結(jié)果

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

表3 菌株的生理生化特性

注：+表示陽(yáng)性反應(yīng)；++ 表示強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；-表示陰性反應(yīng)。

2.2 低氮培養(yǎng)基接種菌株處理對(duì)三倍體毛白楊組培苗生根和生長(zhǎng)的影響

由表4可見(jiàn)，在接種P22和S16菌株的低氮珍珠巖培養(yǎng)基上，三倍體毛白楊莖段根系生長(zhǎng)、苗高生長(zhǎng)和生物量均有明顯提高趨勢(shì)，各培養(yǎng)時(shí)間2種菌株處理的各項(xiàng)指標(biāo)均與對(duì)照達(dá)到顯著差異。培養(yǎng)10 d時(shí)，P22處理組的平均根數(shù)3.13條、平均根長(zhǎng)1.90 cm、平均苗高2.42 cm，S16處理組的平均根數(shù)2.00條、平均根長(zhǎng)1.65 cm、平均苗高2.18 cm，對(duì)照組平均根數(shù)1.19條、平均根長(zhǎng)0.91 cm、平均苗高1.81 cm；P22處理組的平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)和平均苗高分別比未接菌的對(duì)照高163.0%、108.0%、33.7%，S16處理組的分別比未接菌的對(duì)照提高68.1%、81.3%、20.4%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株促進(jìn)生根和生長(zhǎng)的作用仍然明顯：到30 d時(shí)，P22處理組的平均根數(shù)5.50條、平均根長(zhǎng)3.93 cm、平均苗高5.05 cm，S16處理組的平均根數(shù)4.56條、平均根長(zhǎng)3.87 cm、平均苗高4.87 cm，對(duì)照組平均根數(shù)1.88條、平均根長(zhǎng)2.22 cm、平均苗高4.32 cm；P22處理組的平均根長(zhǎng)、平均根數(shù)和平均苗高分別比未接菌的對(duì)照提高193.0%、77.0%和16.9%，S16處理組分別比未接菌的對(duì)照提高142.6%、74.3%、12.7%。S16對(duì)三倍體毛白楊組培苗生根和生長(zhǎng)的促進(jìn)作用和P22相似，但作用不如P22顯著。

在試驗(yàn)中也觀察到，接種10 d時(shí)，未接菌處理的對(duì)照組部分組培苗未生根，且部分呈現(xiàn)輕微的玻璃化，而P22和S16兩個(gè)處理組的組培苗則苗木生長(zhǎng)健壯植株旺盛。培養(yǎng)30 d時(shí)S16、P22處理組三倍體毛白楊組培苗生根和生長(zhǎng)情況如圖2。

2.3 菌株與IBA聯(lián)合處理對(duì)組培苗生根和生長(zhǎng)的影響

統(tǒng)計(jì)分析表明(表5)，P22和S16菌株處理及菌株與IBA聯(lián)合處理，對(duì)三倍體毛白楊生根和生長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用，均顯著優(yōu)于對(duì)照。菌株與IBA聯(lián)合處理效果與僅用菌株處理，促進(jìn)作用無(wú)明顯差異。由此推測(cè)，這兩種內(nèi)生菌可能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素，從而促進(jìn)植物生根。P22與IBA的聯(lián)合處理效果要優(yōu)于S16與IBA的聯(lián)合處理效果。

圖2 30 d時(shí)各處理對(duì)三倍體毛白楊組培苗的生根生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)時(shí)間/d處理生根/條根長(zhǎng)/cm苗高/cm單株鮮質(zhì)量/g單株干質(zhì)量/g10P22(3.13±2.39)a(1.90±1.26)a(2.42±0.71)a——S16(2.00±0.97)b(1.65±0.97)a(2.18±0.65)b——CK(1.19±1.05)c(0.91±0.54)b(1.81±0.79)c——20P22(2.68±1.25)a(3.57±1.97)a(3.83±0.65)a——S16(2.50±1.32)a(3.44±1.93)a(3.79±0.66)a——CK(1.38±0.81)b(1.67±1.84)b(2.99±0.77)b——30P22(5.50±2.53)a(3.93±2.54)a(5.05±1.22)a(0.35±0.06)a(0.04±0.01)aS16(4.56±1.31)b(3.87±2.93)a(4.87±1.43)ab(0.29±0.09)b(0.03±0.01)abCK(1.88±1.59)c(2.22±0.89)b(4.32±1.49)b(0.24±0.06)c(0.03±0.01)b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列同一培養(yǎng)時(shí)間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5 不同質(zhì)量濃度IBA與不同菌株處理對(duì)三倍體毛白楊組培苗生根生長(zhǎng)的影響

處 理生根/條根長(zhǎng)/cm苗高/cmP22(5.50±2.53)ab(3.93±2.54)bc(5.05±1.22)abP22+0.15mg/LIBA(4.60±2.27)b(4.76±2.44)ab(4.73±1.35)bP22+0.30mg/LIBA(6.20±2.97)a(5.28±2.98)a(5.66±2.32)aS16(4.56±1.31)b(3.87±2.93)bc(4.87±1.43)bS16+0.15mg/LIBA(4.50±1.26)b(3.28±1.97)c(4.66±1.37)bS16+0.30mg/LIBA(5.30±1.05)ab(3.45±2.11)c(5.12±1.14)abCK(1.88±1.59)c(2.22±0.89)d(4.32±1.49)c

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 菌株處理對(duì)歐美楊107楊和旱柳硬枝扦插生根的影響

2.4.1 對(duì)歐美楊107楊的影響

菌株P(guān)22和菌株S16處理歐美楊107插穗，可明顯促進(jìn)插穗生根率和根系生長(zhǎng)。由表6可見(jiàn)，扦插后80 d時(shí)，P22處理的插穗生根率達(dá)到90.5%，S16處理達(dá)到90.0%，高于對(duì)照生根率的75%。由于歐美楊107屬易生根樹(shù)種，所以對(duì)生根率的促進(jìn)效果不明顯。與生根率相比，P22和S16對(duì)平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)的促進(jìn)作用更為明顯。扦插后80 d時(shí)，P22處理組平均根數(shù)18.50條、平均根長(zhǎng)23.22 cm，S16處理組平均根數(shù)17.50條、平均根長(zhǎng)19.58 cm，對(duì)照組平均根數(shù)10.50條、平均根長(zhǎng)18.17 cm；P22處理組的平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)比對(duì)照組提高了76.2%和27.8%，均達(dá)到顯著差異；S16處理的平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)比對(duì)照組提高66.7%和7.8%，其中，平均根長(zhǎng)達(dá)到顯著差異。

接菌處理對(duì)扦插苗生物量也有一定的促進(jìn)作用，扦插后80 d時(shí)，P22處理組平均生物量為80.31 g，S16處理組為74.79 g，對(duì)照組為63.98 g；P22處理組的平均生物量與對(duì)照組相比高出25.5%，而S16處理組比對(duì)照組高出16.9%，均與對(duì)照達(dá)到顯著差異。

2.4.2 對(duì)旱柳的影響

菌株處理對(duì)親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的楊柳科柳屬的旱柳硬枝扦插插穗生根和生長(zhǎng)也有明顯的促進(jìn)作用，作用效果和對(duì)歐美楊107的作用相近。由表7可知，扦插后60 d時(shí)，P22處理組平均根數(shù)21.4條、平均根長(zhǎng)9.47 cm，S16處理組平均根數(shù)17.20條、平均根長(zhǎng)8.59 cm，對(duì)照組平均根數(shù)14.0條，平均根長(zhǎng)7.15 cm；P22處理的平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)比對(duì)照提高了52.9%和32.4%，S16處理的平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)比對(duì)照提高22.9%和19.7%，均達(dá)到顯著差異。接菌處理對(duì)扦插苗生物量促進(jìn)作用明顯，扦插后60 d時(shí)，P22處理組平均生物量76.99 g，S16處理組平均生物量44.57 g，對(duì)照組平均生物量32.41 g；P22處理的生物量與對(duì)照相比高出137.6%，而S16處理比對(duì)照高出37.5%，均達(dá)到顯著差異。

表6 菌株P(guān)22和S16對(duì)歐美楊107楊硬枝扦插生根和生長(zhǎng)的影響

扦插時(shí)間/d處理生根率/%生根/條根長(zhǎng)/cm生物量/g20P2280.2(4.75±1.08)a(2.28±1.07)a—S1682.5(4.50±1.73)a(1.78±1.21)ab—CK72.5(1.75±1.25)b(1.66±1.24)b—60P2290.5(18.25±1.71)a(7.71±3.36)a—S1687.5(14.30±2.75)b(7.65±3.83)a—CK75.0(9.75±0.95)c(5.05±3.91)b—80P2290.5(18.50±1.29)a(23.22±9.46)a80.31aS1690.0(17.50±1.91)a(19.58±8.40)b74.79aCK75.0(10.50±4.35)b(18.17±5.87)b63.98b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列同一扦插時(shí)間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表7 菌株P(guān)22和S16對(duì)旱柳硬枝扦插生根和生長(zhǎng)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列同一扦插時(shí)間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

生物固氮研究已有很長(zhǎng)的歷史，特別是越來(lái)越受到人們的重視并且廣范存在于根瘤菌和豆科類(lèi)植物中的共生固氮，這些年也取得了一定進(jìn)展。但是關(guān)于非豆科植物固氮的研究卻少得多。研究證明，植物的一些內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。植物組織中天然存在著內(nèi)生細(xì)菌，它們寄居于植物組織中，存在于植物的整個(gè)或部分生命周期中但不會(huì)對(duì)植物引起明顯的損害[11-12]。目前研究人員已經(jīng)從植物中分離出的內(nèi)生細(xì)菌已超過(guò)129種，主要包括假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬等[2，13]。但對(duì)這些內(nèi)生細(xì)菌在植物組織中的作用至今仍知之甚少，特別是對(duì)來(lái)自多年生木本植物中的內(nèi)生細(xì)菌的作用的研究更少。有文獻(xiàn)記載有的內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)合成或促進(jìn)植物合成生長(zhǎng)激素、固氮作用等來(lái)直接促進(jìn)一些樹(shù)種的生長(zhǎng)，如，馬尾松、楊樹(shù)、芒果、茶樹(shù)、毛竹、桉樹(shù)、銀杏及棗樹(shù)等[14-15]。Siciliano等[16]從油菜的根和莖中進(jìn)行了幾種內(nèi)生細(xì)菌分離工作，研究發(fā)現(xiàn)油菜種子的萌發(fā)速度，幼苗的增加長(zhǎng)度情況等都與分離出來(lái)的這幾種不同內(nèi)生細(xì)菌有或多或少的聯(lián)系。不同的內(nèi)生細(xì)菌其促進(jìn)生長(zhǎng)的機(jī)制也不相同，其中分離出的Paenibacillus屬的內(nèi)生菌促生機(jī)制已被Timmusk等[17]證明是由于分泌植物激素等物質(zhì)來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)的。

在低氮培養(yǎng)基上，用從白楊雜種741楊分離出的2種內(nèi)生細(xì)菌處理三倍體毛白楊組培苗，可促進(jìn)組培苗生根和生長(zhǎng)。說(shuō)明這兩種內(nèi)生細(xì)菌具有一定固氮效果。通過(guò)16S rDNA分子水平序列對(duì)比分析，鑒定出菌株P(guān)22為類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillussp.)、菌株S16屬于寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonassp.)。關(guān)于Paenibacillus已經(jīng)在不同的木本植物中被發(fā)現(xiàn)，像松樹(shù)、咖啡樹(shù)、楊樹(shù)。此外，已知這種菌能產(chǎn)生植物激素，如生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，抗生素和不同的水解酶等，因此屬于植物生長(zhǎng)促進(jìn)菌[7，18]。研究也進(jìn)一步證明，來(lái)自白楊雜種741楊的內(nèi)生細(xì)菌P22和S16不僅可促進(jìn)楊屬的三倍體毛白楊、107楊的生根和生長(zhǎng)，也可明顯促進(jìn)近源種柳屬的旱柳的生根和生長(zhǎng)。即在低氮培養(yǎng)基上可明顯促進(jìn)三倍體毛白楊根系生長(zhǎng)、苗高生長(zhǎng)及生物量提高；用P22和S16處理歐美楊107和旱柳硬枝插穗，可明顯提高插條根系生長(zhǎng)、苗高生長(zhǎng)和生物量。說(shuō)明這兩種內(nèi)生細(xì)菌具有廣泛促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，從而使其在生物肥料中應(yīng)用成為可能。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)P22的促進(jìn)生根生長(zhǎng)的能力更加顯著，而菌株S16稍差，這可能與其本身的促生機(jī)制有一定的關(guān)系，其原因尚待深入的試驗(yàn)研究。

在研究植物內(nèi)生細(xì)菌的促生作用中，研究者[19-22]都是單獨(dú)將菌株與植物材料共培養(yǎng)，來(lái)確定分離出的內(nèi)生菌的促生作用。筆者將內(nèi)生細(xì)菌與植物生長(zhǎng)激素IBA同時(shí)應(yīng)用在植物組織培養(yǎng)材料中，以此來(lái)驗(yàn)證菌株與IBA聯(lián)合作用是否對(duì)植物材料有更強(qiáng)的促進(jìn)效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，這兩種內(nèi)生細(xì)菌與IBA聯(lián)合作用對(duì)三倍體毛白楊組培苗根系生長(zhǎng)和苗木生長(zhǎng)的促進(jìn)作用比單獨(dú)使用內(nèi)生菌處理效果增加不明顯，從而說(shuō)明菌株P(guān)22和S16可能產(chǎn)生植物激素或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植物激素來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

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Effects of Endophytic Bacteria P22 and S16 in Populus on the Rooting and Growth of the Relative Species Plants/

Han Zhixiao, Zhang Zekun, Dong Yan, Yang Minsheng(Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, P. R. China); Dietrich Ewald(Institude for Genetics and Forest Tree Breeding, Federal research Centre for Forestry and Forest Products)//

韓志校，女，1987年5月生，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

楊敏生，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：yangms100@aliyun.com。

2013年10月22日。

S792.112

1) 林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)重大項(xiàng)目(201004004)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”計(jì)劃(2011AA100201)。

責(zé)任編輯：程 紅。