不同生長(zhǎng)時(shí)期東北紅豆杉針葉內(nèi)防御蛋白的變化1)

谷岱霏 胡 曉 劉 彤 趙玉田 嚴(yán)善春

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040) (黑龍江省伊春市五營(yíng)林業(yè)局) (東北林業(yè)大學(xué))

不同生長(zhǎng)時(shí)期東北紅豆杉針葉內(nèi)防御蛋白的變化1)

谷岱霏 胡 曉 劉 彤 趙玉田 嚴(yán)善春

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040) (黑龍江省伊春市五營(yíng)林業(yè)局) (東北林業(yè)大學(xué))

為研究不同生長(zhǎng)時(shí)期東北紅豆杉(TaxuscuspidataSieb. et Zucc.)針葉內(nèi)防御蛋白的變化，分別對(duì)5、7、9月份的東北紅豆杉雌、雄株針葉內(nèi)防御蛋白PPO、PAL、POD、CAT、TI和CI活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：不同生長(zhǎng)時(shí)期東北紅豆杉防御蛋白的活性差異顯著(P<0.05)，除POD活性在9月份達(dá)到最高值外，PPO、PAL、CAT、TI和CI的活性均在7月份達(dá)到最高值；不同生長(zhǎng)時(shí)期雌、雄株防御蛋白活性的變化趨勢(shì)基本一致。

東北紅豆杉；防御蛋白；生長(zhǎng)時(shí)期

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-48～50

We measured the activities of PPO, PAL, POD, CAT, TI and CI in the leaves of female and maleTaxuscuspidateSieb. et Zucc. in May, July and September to investigate the seasonal variations of defense protein activities in leaves. The activities of defense proteins were all significantly different among the different months (P<0.05). The activities of PPO, PAL, CAT, TI and CI all peaked in July, and the activity of POD peaked in September. The female and male tree leaves were in the same trend.

KeywordsTaxuscuspidate; Defense proteins; Seasonal variations

東北紅豆杉(TaxuscuspidataSieb. et Zucc.)是常綠針葉喬木，中國(guó)一級(jí)珍稀瀕危樹(shù)種。東北紅豆杉天然分布區(qū)非常狹窄，在國(guó)內(nèi)主要集中在吉林和龍、天橋嶺、汪清、琿春和黑龍江省穆棱等地[1]。野外調(diào)查結(jié)果表明，天然東北紅豆杉極少受到病蟲(chóng)害侵染，說(shuō)明其具有一定的抗病蟲(chóng)能力，但其抗病蟲(chóng)機(jī)理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，特別是從化學(xué)生態(tài)和植物生理方面研究其抗性組成的研究尚屬空白。與植物組成抗蟲(chóng)性密切相關(guān)的防御蛋白，包括多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御性酶系，過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等保護(hù)性酶系以及胰蛋白酶抑制劑(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI)等蛋白酶抑制劑(PIs)，這些防御蛋白可以作為檢驗(yàn)植物抗蟲(chóng)性的指標(biāo)[2-3]。林木組成抗性受很多因素的影響，易隨光照、溫濕度等環(huán)境因子和植物營(yíng)養(yǎng)、植物成熟度而變化[4]，因此，植株處于不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，必然會(huì)導(dǎo)致其體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的相應(yīng)改變。

為了研究天然東北紅豆杉在春、夏、秋季節(jié)的組成抗蟲(chóng)特性，筆者分別測(cè)定分析5、7、9月份3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期東北紅豆杉針葉內(nèi)防御蛋白的變化，以期了解防御蛋白與生長(zhǎng)時(shí)期的關(guān)系，探尋防御蛋白在其抗蟲(chóng)性中的作用，為林木害蟲(chóng)的防控提供新理論和新思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料

在黑龍江省南部穆棱東北紅豆杉自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，在相同立地條件下，分別于5、7、9月份，選擇胸徑為40～50 cm(保護(hù)區(qū)內(nèi)典型胸徑)東北紅豆杉雌、雄株各10株。在每個(gè)植株上采集樹(shù)冠中部陽(yáng)面當(dāng)年生枝條的針葉，將從每株采到的針葉分別裝入夾鏈袋內(nèi)，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室，冰箱中，-40 ℃保存待測(cè)。

1.2 儀器與試劑

儀器：電子天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)、D-37520冷凍離心機(jī)(德國(guó))、電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、UV-240紫外分光光度計(jì)(Biochtom Ltd.Cambridge CB4 OF J.England)。

試劑：愈創(chuàng)木酚、過(guò)氧化氫、濃鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硼酸、氯化鈣為國(guó)產(chǎn)藥品；聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)、Triton X-100、巰基乙醇(Mer)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base)、抗壞血酸(VC)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均為AMRESCO公司產(chǎn)品；苯丙氨酸為WAKO公司產(chǎn)品；咖啡酸、苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE)、N-苯甲酰-L-酪氨酸乙脂(BTEE)為SIGMA公司產(chǎn)品。

1.3 測(cè)定方法

取1 g針葉鮮樣，在液氮冷凍條件下充分碾碎，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

防御酶活性測(cè)定：多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定參照劉艷的咖啡酸比色法[5]，于470 nm下測(cè)定吸光度，以1 min內(nèi)OD470變化0.01的酶量為1個(gè)酶活力單位。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定參照Z(yǔ)ong等的苯丙氨酸比色法[6]，于290 nm下測(cè)定吸光度，以1 min內(nèi)OD290變化0.01的酶量為1個(gè)酶活力單位。

保護(hù)酶活性測(cè)定：過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定參照李合生的愈創(chuàng)木酚法[7]，于470 nm下測(cè)定吸光度，以1 min內(nèi)OD470變化0.01的酶量為1個(gè)酶活力單位。過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參照王晶英等的過(guò)氧化氫氧化法[8]，于240 nm下測(cè)定吸光度，以1 min內(nèi)OD240變化0.1的酶量為1個(gè)酶活力單位。

蛋白酶抑制劑活性測(cè)定：胰蛋白酶抑制劑(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI)活性測(cè)定參照徐偉的方法[9]，分別于256和253 nm下測(cè)定吸光度，以1 min內(nèi)蛋白酶抑制劑活力降低0.001的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0軟件，采用One-Way ANOVA分析不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)東北紅豆杉針葉內(nèi)防御蛋白變化的影響，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 防御酶活性隨生長(zhǎng)時(shí)期的變化

東北紅豆杉針葉內(nèi)PPO活性，在5、7、9月份之間的差異顯著(P<0.05)，5和9月份顯著低于7月份(P<0.05)(表1)。雌、雄株針葉內(nèi)PPO活性的變化趨勢(shì)和差異顯著水平保持一致，且均在7月份達(dá)到最高值。7月份PPO活性雄株約為雌株的2倍。東北紅豆杉針葉內(nèi)PAL活性，在不同月份中差異均顯著(P<0.05)，5月份顯著低于7月份和9月份(P<0.05)；7月份和9月份之間酶活性差異較與5月份的小，差異顯著(P<0.05)。雌、雄株針葉內(nèi)PAL活性非常接近，且均在7月份達(dá)到最高值，變化趨勢(shì)和差異顯著水平保持一致(表1)。

表1 不同生長(zhǎng)時(shí)期東北紅豆杉針葉內(nèi)防御蛋白活性 U·g-1

月份CAT雌株雄株TI雌株雄株CI雌株雄株5(0.0016±0)c(0.0024±0)c(47.015±1.281)b(36.450±1.293)b(92.992±6.266)c(91.392±8.427)c7(0.0076±0.001)a(0.0039±0.001)a(78.065±2.667)a(91.290±2.581)a(247.841±19.456)a(171.582±18.478)a9(0.0034±0.001)b(0.0031±0)b(32.419±1.965)c(25.290±1.302)c(137.939±16.927)b(113.024±11.234)b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 保護(hù)酶活性隨生長(zhǎng)時(shí)期的變化

東北紅豆杉針葉內(nèi)POD活性，在不同月份中差異均顯著(P<0.05)，9月份顯著高于5和7月份(P<0.05)。雌、雄株針葉內(nèi)POD活性均在9月份達(dá)到最高值，但在5和7月份雌、雄株變化趨勢(shì)不同，其中雌株7月份顯著高于5月份，而雄株5月份顯著高于7月份(表1)。CAT活性，在5、7、9月份之間的差異顯著(P<0.05)，5月份顯著低于7和9月份(P<0.05)(表1)。雌、雄株針葉內(nèi)CAT活性的變化趨勢(shì)和差異顯著水平保持一致，且均在7月份達(dá)到最高值。7月份CAT活性雌株約為雄株的2倍。

2.3 蛋白酶抑制劑活性隨生長(zhǎng)時(shí)期的變化

東北紅豆杉針葉內(nèi)TI活性，在不同月份中差異均顯著(P<0.05)，7月份最高，5月份次之、9月份最低。雌、雄株針葉內(nèi)TI活性的變化趨勢(shì)和差異顯著水平保持一致，且均在7月份達(dá)到最高值。7月份TI活性雌株略低于雄株，5和9月份雌株略高于雄株(表1)。CI活性，在5、7、9月份之間差異顯著(P<0.05)，CI活性由高至低依次為7月份、9月份、5月份(表1)。雌、雄株針葉內(nèi)CI活性的變化趨勢(shì)和差異顯著水平保持一致，且均在7月份達(dá)到最高值。

3 結(jié)論與討論

在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，植物和昆蟲(chóng)及病原體不斷相互作用，彼此形成了許多防御及適應(yīng)機(jī)制，因此植物自身起防御作用的物質(zhì)會(huì)隨植物的生長(zhǎng)時(shí)期的不同做出相應(yīng)的調(diào)整從而應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)害的發(fā)生期[10]。本研究表明，在不同生長(zhǎng)時(shí)期東北紅豆杉針葉內(nèi)防御蛋白的活性變化差異顯著(P<0.05)，PPO、PAL、CAT、CI的活性由高到低依次為7月份、9月份、5月份(P<0.05)，TI的活性為7月份、5月份、9月份(P<0.05)；5種防御蛋白活性均在7月份達(dá)到最高值，且雌、雄株的變化趨勢(shì)和差異顯著水平保持一致。但不同的是，POD活性在9月份達(dá)到最高值。本研究證明：東北紅豆杉的防御機(jī)制可以有效適應(yīng)病蟲(chóng)害的發(fā)生期，即在不同生長(zhǎng)時(shí)期葉內(nèi)防御蛋白活性的變化與東北地區(qū)病蟲(chóng)害大發(fā)生時(shí)期的變化趨勢(shì)相同。例如，東北地區(qū)舞毒蛾5月上旬開(kāi)始孵化，7月上旬發(fā)育至取食量最大的6齡幼蟲(chóng)[11]；東北紅豆杉的防御蛋白活性也從5月進(jìn)入上升期，7月達(dá)到最大值。這種有效分配防御物質(zhì)應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)害的防御機(jī)制是野生東北紅豆杉很少遭受病蟲(chóng)害的原因之一。

與石蕾等[12]的研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，同時(shí)期的東北紅豆杉針葉內(nèi)防御蛋白活性顯著高于落葉松針葉內(nèi)防御蛋白活性。東北紅豆杉中除防御蛋白外，還存在其他重要的次生防御物質(zhì)以抵抗病蟲(chóng)害侵襲。胡曉等[13]研究表明，紫杉醇和三尖杉寧堿都具有對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)的拒食活性。常醉等[14]研究表明，隨著營(yíng)養(yǎng)時(shí)期的變化，東北紅豆杉枝中紫杉醇和三尖杉寧堿含量從4月份到10月份整體呈先上升后下降并趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)；7月份東北紅豆杉防御蛋白和兩種紫杉烷類物質(zhì)的含量均高于5月份和9月份，有利于抵抗病蟲(chóng)害的侵襲。這也從生理生化角度解釋了東北紅豆杉很少遭受昆蟲(chóng)侵襲的原因。

本研究表明，7月份東北紅豆杉針葉內(nèi)CAT、CI的活性雌株顯著高于雄株，PPO的活性雄株顯著高于雌株；雌、雄株側(cè)重利用不同的防御蛋白發(fā)揮防御功能，說(shuō)明東北紅豆杉雌、雄株應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)害可能采取不同的防御策略。

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Seasonal Variations of Defense Protein Activities inTaxuscuspidateLeaves/

Gu Daifei, Hu Xiao, Liu Tong(Northeast Foestry University, Harbin 150040, P. R. China ); Zhao Yutian(Forestry Bureau of Wuying, Yichun, Heilongjiang); Yan Shanchun(Northeast Forestry University)//

1) 國(guó)家自然基金項(xiàng)目(30870464)。

谷岱霏，女，1991年1月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

嚴(yán)善春，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：yanshanchun@126.com。

2014年3月5日。

S791.49

責(zé)任編輯：程 紅。