Bevacizumab對視網(wǎng)膜色素上皮細胞纖維化相關因子表達的影響△

張敏 儲三軍 曾繁星 徐海峰

Bevacizumab對視網(wǎng)膜色素上皮細胞纖維化相關因子表達的影響△

張敏 儲三軍 曾繁星 徐海峰

Bevacizumab;視網(wǎng)膜色素上皮細胞;纖維化;細胞因子

目的觀察Bevacizumab 對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞纖維化相關因子基因及蛋白表達的影響，探討B(tài)evacizumab 在新生血管纖維化中的作用。方法用含終濃度0.25 g·L-1Bevacizumab 的DMED/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)ARPE-19細胞，按Bevacizumab 處理的時間分為0 h、6 h、12 h、24 h和48 h共5組，0 h為對照組。不同時間點收集細胞及上清。用逆轉錄聚合酶鏈反應檢測ARPE-19細胞中結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉化生長因子-β2(transforming growth factor β2,TGF-β2)和基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)的mRNA相對表達量。采用ELISA檢測上清中CTGF、bFGF和 TGF-β2的蛋白濃度,應用免疫蛋白印跡法 (Western blotting)檢測MMP-2蛋白的表達。結果Bevacizumab 作用后6 h、12 h、24 h和48 h,CTGF、 bFGF、TGF-β2及MMP-2 的mRNA相對表達量分別為CTGF：1.694±0.160、1.994±0.221、1.733±0.057、1.397±0.075，bFGF：1.720±0.068、2.144±0.080、1.893±0.068、1.372±0.076，TGF-β2：1.356±0.070、1.737±0.515、1.576±0.098、1.439±0.050，MMP-2：1.414±0.115、1.644±0.094、1.435±0.075、1.285±0.024，與對照組相比均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。ELISA結果顯示Bevacizumab 作用后6 h、12 h、24 h和48 h,CTGF 、bFGF、TGF-β2蛋白的表達量與對照組相比均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；對照組及各時間組蛋白濃度分別為CTGF：(31.949±0.388)ng·L-1、(48.697±0.863)ng·L-1、(56.847±0.499)ng·L-1、(51.753±1.395)ng·L-1、(43.085±1.240)ng·L-1，bFGF：(26.660±1.360)ng·L-1、(46.529±3.297)ng·L-1、(55.883±1.705)ng·L-1、(47.937±1.303)ng·L-1、(36.894±2.532)ng·L-1，TGF-β2：(26.982±2.404)ng·L-1、(35.452±1.360)ng·L-1、 (46.787±0.896)ng·L-1、(43.683±1.630)ng·L-1、(38.008±1.110)ng·L-1。Western blotting結果顯示，Bevacizumb處理后6 h、12 h、24 h、48 h MMP-2蛋白含量升高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=2620.429，P=0.000)。結論Bevacizumab 能夠上調人RPE細胞中CTGF、bFGF、TGF-β2及MMP-2的表達，可能有促纖維化形成的作用。

[眼科新進展，2014，34(4)：318-321]

Bevacizumab 是人源化抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的IgG單克隆抗體，被美國食品藥品安全局批準用于治療結腸癌，現(xiàn)在被廣泛用于脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)性疾病的治療[1]，其療效及安全性均得到確認。然而，研究發(fā)現(xiàn)濕性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)患者接受抗VEGF治療后可發(fā)生嚴重的黃斑部視網(wǎng)膜下纖維膜增殖，這些患者均無明顯的黃斑部視網(wǎng)膜下出血，因而排除了局部出血導致纖維化的可能[2]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞能夠分泌多種細胞因子，參與多種病理改變的過程，在CNV的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。其分泌的結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉化生長因子-β2(transforming growth factor β2,TGF-β2)和基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)能夠促進纖維化發(fā)生[3]。Bevacizumab治療后黃斑下纖維膜的發(fā)生機制不清，是否與RPE細胞功能改變有關尚不得而知。因此，本研究將在體外觀察Bevacizumab是否影響RPE細胞表達上述與纖維化相關的細胞因子，從而探究Bevacizumab促纖維化的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1材料人RPE細胞系ARPE-19 (美國ATCC公司，CRL-2302)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，胎牛血清(美國Invitrogen公司)，胰蛋白酶(美國Invitrogen公司)，總RNA提取試劑盒(美國Macherey-nagel公司)，反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，人CTGF、bFGF、TGF-β2ELISA試劑盒(美國R&D公司)。MMP-2抗體(兔抗人抗體，美國Abcam公司)，羊抗兔熒光二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組ARPE-19細胞按說明復蘇、培養(yǎng)(DMEM/F12 培養(yǎng)液含體積分數(shù)10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素、0.1 g·L-1鏈霉素，于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng))、傳代。細胞達足夠數(shù)量后以每孔400×103接種于6孔板。按Bevacizumab處理的時間分為0 h、6 h、12 h、24 h和48 h 5組，0 h為對照組。Bevacizumab終濃度為0.25 g·L-1。

1.2.2RT-PCR檢測CTGF、bFGF、TGF-β2及MMP-2的mRNA表達水平在不同時間點收集細胞，按照試劑盒說明提取各組細胞mRNA。根據(jù)反轉錄試劑盒說明書對提取的VEGF、CTGF、bFGF、TGF-β2及MMP-2的mRNA進行反轉錄。引物由大連寶生物有限公司設計并合成，引物序列見表1。 PCR反應條件：95 ℃預變性10 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共50個循環(huán)。獲取各組樣品的標準曲線，以GAPDH為內參分析其Ct值。根據(jù)公式2-(ΔCt GAPDH-ΔCt 樣品)算出待測樣品相對值。實驗重復3次。

1.2.3ELISA法檢測CTGF、bFGF、TGF-β2蛋白表達不同時間點收集細胞培養(yǎng)的上清。高速冷凍離心機(溫度設定為4 ℃)1000 r·min-1離心5 min，小心留取上清液，于4 ℃保存，按照R&D公司提供的試劑盒說明書進行操作。

1.2.4Westernblotting測定MMP-2蛋白的表達不同時間點收集細胞，提取各組細胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按每個樣本50 μg總蛋白上樣，100 g·L-1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；4 ℃，100 mA電轉膜3 h，50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加MMP-2一抗(濃度為1800)4 ℃過夜。第2天滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(山羊抗兔IgG，濃度為 13000)室溫孵育1 h。免疫反應結束后用Western blotting熒光劑發(fā)光、顯影。Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)照相，應用Image J圖像分析軟件，通過目的基因與內參條帶的吸光度值比值進行目的蛋白的相對含量分析。

表1 RT-PCR SYBR Green法引物序列Table 1 Primer sequence of SYBR Green RT-PCR

2 結果

2.1RT-PCR檢測不同時間點CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2的mRNA表達CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2 的mRNA表達量在對照組、6 h組、12 h組、24 h組和48 h組五組間總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。6 h組、12 h組、24 h組和48 h組的CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2 的mRNA表達量高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P=0.000,見表2)。

表2 Bevacizumab對ARPE-19細胞CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2的mRNA表達的影響Table 2 Effects of Bevacizumab on expressions of CTGF, bFGF, TGF-β2 and MMP-2 mRNA in ARPE-19 cells(±s)

2.2ELISA檢測Bevacizumb對ARPE-19細胞CTGF、bFGF、TGF-β2蛋白表達的影響CTGF、bFGF、TGF-β2蛋白表達量在對照組、6 h組、12 h組、24 h組和48 h組5組間總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。6 h組、12 h組、24 h組和48 h組的CTGF、bFGF、TGF-β2的蛋白表達量高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(表3)。

2.3Westernblotting檢測各組MMP-2蛋白表達Bevacizumb處理6 h、12 h、24 h和48 h后，MMP-2蛋白相對表達量分別為2.18±0.03、2.81±0.01、2.20±0.01和1.80±0.01，均較對照組(1.46±0.03)升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01；見圖1)。

表3 Bevacizumab對ARPE-19細胞CTGF、bFGF、TGF-β2蛋白表達的影響Table 3 Effects of Bevacizumab on expressions of CTGF, bFGF and TGF-β2 protein in ARPE-19 cells(±s，ρ/ng·L-1)

3 討論

玻璃體腔注射VEGF單克隆抗體被越來越多地用于眼部新生血管性疾病的治療[4-7]。Bevacizumab可以與VEGF-A所有亞型結合，使內源性的VEGF失去活性，有效減少血管滲漏、使新生血管萎縮。然而隨著抗VEGF制劑的廣泛應用及隨訪時間延長，人們發(fā)現(xiàn)抗VEGF治療后無論是CNV還是視網(wǎng)膜新生血管均可發(fā)生嚴重的纖維化，接受玻璃體腔注射Bevacizumab 后，AMD的患者可發(fā)生纖維膜增殖，增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者可發(fā)生新生血管纖維化而導致牽拉性視網(wǎng)膜脫離[8-9]。雖然纖維化是新生血管的必然結局，但抗VEGF治療與纖維化的因果關系尚不清楚。在糖尿病患者的纖維血管膜中CTGF、bFGF、TGF-β2以及MMP-2的表達量是明顯升高的[10-13]。我們推測這些因子可能也參與AMD中CNV纖維化的形成，因此本研究監(jiān)測了Bavacizumab對RPE細胞的影響，結果表明Bevacizumab 可改變RPE細胞纖維化相關細胞因子的表達，上調CTGF、bFGF、TGF-β2、MMP-2的表達水平，從而促進纖維化形成。

CTGF是目前有關纖維化研究最多的因子之一，研究發(fā)現(xiàn)多種組織細胞都可表達CTGF，而且在組織過度纖維化、創(chuàng)傷修復、血管形成、腫瘤生長、發(fā)育分化等方面有著重要的作用[14]，Van Geest等[8]發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體腔注射Bevacizumab 后CTGF/VEGF的比值升高，認為CTGF是促纖維化形成的重要因子，將來有可能成為新生血管治療的新的靶點。我們的研究結果也顯示了Bevacizumab 可以上調CTGF的表達，這一結果進一步說明了抗VEGF治療同時采取抗纖維化治療的必要性。TGF-β2是轉化TGF-β中一員，是CTGF的上游信號，對單核細胞和成纖維細胞有趨化作用，促進炎癥反應和纖維形成，并可以刺激成纖維細胞分泌纖連蛋白參與細胞外基質的形成，F(xiàn)orooghian等[15]發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者在玻璃體內注射抗VEGF藥物后玻璃體腔中TGF-β2的含量會增加。我們的體外實驗研究也證實了Bevacizumab 可以促進RPE細胞分泌TGF-β2，與上述結果相符。

MMP-2與bFGF也是與纖維化密切相關的細胞因子。研究證實PDR患者視網(wǎng)膜前膜中MMP-2大量分布于視網(wǎng)膜纖維血管膜的RPE細胞和神經(jīng)膠質細胞中，說明MMP-2可能參與了纖維血管膜的形成[16]。MMP-2可以降解明膠、IV型膠原、V型膠原、VⅡ型膠原、纖維連接蛋白和彈性蛋白，使RPE細胞等失去了原有的生存環(huán)境，在異常環(huán)境中，RPE細胞可以產(chǎn)生新的細胞外基質，進而誘導纖維血管膜的形成。bFGF 可以調節(jié)細胞生長與分化，促進細胞分裂使其大量增生并可誘導血管內皮細胞上調CTGF的表達。在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變中bFGF的表達量也明顯增加[10]。玻璃體腔注射抗VEGF藥物后新生血管膜纖維化是否有 bFGF和 MMP-2的參與尚未見報道。本研究的體外實驗結果表明Bevacizumab 使得RPE細胞中bFGF和 MMP-2的 mRNA及蛋白表達均增加，證實了Bevacizumab也有可能通過上調bFGF和 MMP-2的表達參與纖維化的形成。

本研究觀察了Bevacizumab對人RPE細胞分泌的纖維化相關因子表達的影響，證明Bevacizumab有促纖維化形成的作用，而這一作用是通過調控一系列細胞因子的表達來實現(xiàn)的。但這些因子之間的具體相互作用以及是否還有其他因子，如炎癥因子的參與，都有待進一步深入研究。

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date：Nov 25,2013

Science and Technology Project of Qingdao(No：13-1-3-69-nsh)From theSchoolofMedecineandLifeScience,UniversityofJinan,ShandongAcademyofMedicalSciences,ShandongEyeInstitute(ZHANG Min),Jinan250022,ShandongProvince,China;QingdaoEyeHospital,ShandongEyeInstitute(ZHANG Min,CHU San-Jun，ZENG Fan-Xing，XU Hai-Feng)Qingdao266071,ShandongProvince,China

Effects of Bevacizumab on fibrosis associated cytokines expression in human retinal pigment epithelial cells

ZHANG Min,CHU San-Jun，ZENG Fan-Xing，XU Hai-Feng

Bevacizumab; retinal pigment epithelial cells; fibrosis; cytokines

Objective To evaluate the effects of Bevacizumab on expressions of cytokines associated with fibrosis in gene and protein levels in human retinal pigment epithelial cells, and further investigate the possible role of Bevacizumab in the process of new vascular fibrosis. Methods Human retinal pigment epithelial cells were incubated in DMEM/F12 medium containing 0.25 g·L-1Bevacizumab. Cells were divided into 5 groups according to incubation period: 0 hour, 6 hours, 12 hours, 24 hours and 48 hours, 0 hour served as control. The cells and supernatant were collected at different time points. The mRNA and protein levels of connective tissue growth factor (CTGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor-β2 (TGF-β2)and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2)were evaluated by RT-PCR and ELISA or Western blotting, respectively.Results The mRNA levels at 6 hours, 12 hours, 24 hours and 48 hours were as following, CTGF: 1.694±0.160, 1.994±0.221, 1.733±0.057, 1.397±0.075; bFGF: 1.720±0.068, 2.144±0.080, 1.893±0.068, 1.372±0.076; TGF-β2: 1.356±0.070, 1.737±0.515, 1.576±0.098, 1.439±0.050; MMP-2: 1.414±0.115, 1.644±0.094, 1.435±0.075, 1.285±0.024. Compared with control group, the mRNA levels were increased at all time points after incubation with Bevacizumab (allP<0.05). ELISA and Western blotting analysis showed that the protein levels of CTGF, bFGF, TGF-β2 and MMP-2 increased after treatment with Bevacizumab and the differences were statistically significant (allP<0.05).The protein concentrations of each group were as following, CTGF: (31.949±0.388)μg·L-1, (48.697±0.863)μg·L-1, (56.847±0.499)μg·L-1,(51.753±1.395)μg·L-1,(43.085±1.240)μg·L-1; bFGF: (26.66±1.36)μg·L-1, (46.529±3.297)μg·L-1,(55.883±1.705)μg·L-1,(47.937±1.303)μg·L-1,(36.894±2.532)μg·L-1; TGF-β2: (26.982±2.404)μg·L-1,(35.452±1.360)μg·L-1, (46.787±0.896)μg·L-1, (43.683±1.630)μg·L-1, (38.008±1.110)μg·L-1. MMP-2 protein levels at 6 hours, 12 hours, 24 hours and 48 hours after incubation with Bevacizumab were all increased, the differences were statistically significant among different groups(F=2620.429,P=0.000).Conclusion Bevacizumab can up-regulate both mRNA and protein expression of CTGF, bFGF, TGF-β2 and MMP-2 in human retinal pigment epithelial cells, which indicates hat Bevacizumab may have pro-fibrotic effects.

張敏，女，1987年4月出生,山東德州人，碩士。研究方向：眼底病。聯(lián)系電話：18765979700；E-mail：zm4126067@163.com

AboutZHANGMin：Female,born in April,1987.Master degree.Tel:18765979700； E-mail:zm4126067@163.com

2013-11-25

青島市科技計劃項目(編號：13-1-3-69-nsh)

250022 山東省濟南市，濟南大學，山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東省眼科研究所(張敏)；266071 山東省青島市，山東省眼科研究所青島眼科醫(yī)院(張敏，儲三軍，曾繁星，徐海峰)

徐海峰，E-mail：chxhf@126.com

張敏,儲三軍,曾繁星,徐海峰.Bevacizumab對視網(wǎng)膜色素上皮細胞纖維化相關因子表達的影響[J].眼科新進展,2014,34(4):318-321.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0086

修回日期:2013-12-13

本文編輯：董建軍

Accepteddate:Dec 13,2013

Responsibleauthor:XU Hai-Feng，E-mail：chxhf@126.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(4):318-321]