COX-2抑制劑對(duì)NMDA損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制研究△

徐露 田晗 李玉桑 姚光強(qiáng) 唐和斌 奉黎靜 劉敏

COX-2抑制劑對(duì)NMDA損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制研究△

徐露 田晗 李玉桑 姚光強(qiáng) 唐和斌 奉黎靜 劉敏

視網(wǎng)膜；N-甲基-D天冬氨酸；COX-2抑制劑; 細(xì)胞凋亡；神經(jīng)保護(hù)

目的探討COX-2抑制劑NS398對(duì)N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜損傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用。方法25只大鼠隨機(jī)分成5組：正常組、NMDA組、NMDA+不同劑量NS-398(1 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1)組。NMDA組于大鼠雙眼玻璃體內(nèi)注射5 μL NMDA(40 nmol·L-1)，NMDA+不同劑量NS-398組于大鼠雙眼玻璃體內(nèi)注射5 μL NMDA(40 nmol·L-1)及NS-398(1 ng·mL-1，10 ng·mL-1，100 ng·mL-1)。7 d后，取眼球組織，并對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(retinal ganglion cell layer,RGCL)神經(jīng)元數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用TUNEL法和免疫組織化學(xué)染色分別測(cè)定RGCL神經(jīng)元的凋亡以及視網(wǎng)膜組織中caspase-3、COX-2的表達(dá)。結(jié)果NMDA組大鼠RGCL神經(jīng)元數(shù)目為正常大鼠的(47±3)%，與NMDA組比較，NMDA+NS-398組的RGCL神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，低、中、高三種劑量組RGCL神經(jīng)元數(shù)目依次為正常組的(63±5)%、(82±7)%、(73±3)%；NMDA組caspase-3的表達(dá)為正常組的(327±21)%， NMDA+NS-398組caspase-3的表達(dá)顯著下調(diào)，低、中、高三種劑量組caspase-3的表達(dá)依次為正常組的(223±14)%、(197±18)%、(261 ±16)%；NMDA組COX-2的表達(dá)為正常組的(315±11)%，NMDA+NS-398組的表達(dá)顯著下調(diào)，低、中、高三種劑量組COX-2的表達(dá)依次為正常組的(280±20)%、(233±16)%、(255±19)%。結(jié)論抑制COX-2表達(dá)能夠抑制NMDA導(dǎo)致的RGCL細(xì)胞凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜產(chǎn)生保護(hù)作用。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(4)：301-305]

視網(wǎng)膜病變的臨床癥狀主要為不同程度的視力障礙，包括青光眼、黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等疾病。很多證據(jù)表明視網(wǎng)膜缺血可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)凋亡，視網(wǎng)膜興奮性氨基酸主要為谷氨酸和天冬氨酸[1]。在青光眼、黃斑變性等眼病中，視神經(jīng)元的損傷主要是由于興奮性氨基酸受體如N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體被過激活[2]，NMDA受體引起細(xì)胞內(nèi)的鈣離子通道開放，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，過多的鈣離子激活了許多鈣離子相關(guān)的蛋白酶，如核酸內(nèi)切酶、蛋白酶、一氧化氮合酶，鈣蛋白酶通過介導(dǎo)的細(xì)胞膜骨架及機(jī)構(gòu)蛋白的過度降解可引起細(xì)胞丟失[3]，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(retinal ganglion cell layer,RGCL)神經(jīng)元凋亡。NS-398是環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的一種選擇性抑制劑[4],COX-2在炎癥過程中起著重要作用，可促進(jìn)血管擴(kuò)張，同時(shí)發(fā)揮致熱、致痛效應(yīng)[5]，導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過建立NMDA誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜損傷模型，觀察視網(wǎng)膜組織中視神經(jīng)元數(shù)目變化與COX-2、凋亡蛋白caspase-3等表達(dá)的相互關(guān)系，并闡明其相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1.1.1主要儀器切片機(jī)(德國(guó)，Leica Rm2265)，石蠟包埋機(jī)(德國(guó)，Leica EG0050H)，脫水機(jī)(德國(guó)，Leica TP1020)，攤片機(jī)(德國(guó)，Leica HI1210)，烘片機(jī)(德國(guó)，Leica 1220)，顯微鏡系統(tǒng)(日本，Nikon Eclipse Ti)，高速臺(tái)式離心機(jī)(上海，安亭TGL-20B)，NuanceTM多光譜顯微成像系統(tǒng)(凱隆國(guó)際實(shí)業(yè)有限公司)。

1.1.2主要試劑NMDA(Sigma 公司，美國(guó))，NS-398(Beyotime 公司，中國(guó))，戊巴比妥鈉(Merk，德國(guó))，硫酸阿托品(安陽九州藥業(yè))，鹽酸利多卡因注射液(山東華魯制藥有限公司)，氧氟沙星滴眼液(鄭州卓峰制藥有限公司)，諾氟沙星滴眼液(武漢五景藥業(yè)有限公司)，TUNEL試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，caspase-3抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，COX-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，福爾馬林(Sigma公司，美國(guó))，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物及分組雄性SD健康大鼠25只，體質(zhì)量150～200 g，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為5組：正常組、NMDA組、NMDA+不同劑量NS-398(1 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1)組，每組5只。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和處理均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南》[8]。

1.2.2動(dòng)物造模及給藥方法動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后，制備大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷模型。除正常組外，各組大鼠腹腔注射3 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉，雙眼滴入10 g·L-1硫酸阿托品擴(kuò)瞳以及鹽酸利多卡因局部麻醉。具體方法為：采用尖頭微量注射器于NMDA組的大鼠雙眼玻璃體內(nèi)注射5 μL NMDA(40 nmol·L-1)；NMDA+NS-398低、中、高劑量組的大鼠雙眼玻璃體內(nèi)混合注射5 μL NMDA(40 nmol·L-1)及NS-398(1 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1)。隨后，繼續(xù)飼養(yǎng)并每天采用氧氟沙星滴眼液和諾氟沙星滴眼液處理(每天1次)，以預(yù)防感染。

1.2.3取材NMDA處理后第7天處死各組大鼠。摘取雙眼眼球組織，福爾馬林固定，24 h后用流水沖洗2 h，然后梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色測(cè)定COX-2、caspase-3的表達(dá)各組每只大鼠任意選取3張石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟；滴加新制體積分?jǐn)?shù)3%雙氧水，置于濕盒中，室溫靜置15 min，蒸餾水沖洗。10 g·L-1胰酶覆蓋，濕盒37 ℃保持1 h，PBS沖洗。血清封閉40 min后甩干，各組每片分別滴加100 μL COX-2抗體(抗鼠)和 caspase-3抗體(抗鼠)，4 ℃保存過夜。PBS沖洗，每片滴加二抗，室溫保持30 min，PBS沖洗。DAB發(fā)色。蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度甲醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，并用NuanceTM多光譜進(jìn)行定量分析處理。

1.2.5HE染色測(cè)定RGCL神經(jīng)元數(shù)目各組每只大鼠任意選取3張石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水清洗。蘇木精染色，流水沖洗。伊紅染色，蒸餾水清洗，梯度甲醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。隨機(jī)選取三個(gè)視野，于顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜厚度并對(duì)RGCL神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法：同一倍率下，記錄RGCL長(zhǎng)為200 μm(長(zhǎng)度以標(biāo)尺為準(zhǔn)，平行于RGCL方向)的任意區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目，取平均值。

1.2.6TUNEL法測(cè)定RGCL神經(jīng)元的凋亡各組每只大鼠任意選取3張石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟；滴加新制體積分?jǐn)?shù)3%雙氧水，室溫保持10 min；0.01 mol·L-1TBS沖洗，蛋白酶K濕盒37 ℃消化15 min；每片標(biāo)本加20 μL標(biāo)記緩沖液，以保持切片濕潤(rùn)，甩去切片上多余的液體后，每片加20 μL TUNEL反應(yīng)液，置于濕盒中37 ℃保持2 h。TBS沖洗。每片加封閉液50 μL，室溫保持30 min后甩去。用抗體稀釋液稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片滴加50 μL，置于37 ℃濕盒中30 min，TBS沖洗。甩去其他水分，將用抗體稀釋液稀釋后的SABC滴加至標(biāo)本片上，每片50 μL，置于37 ℃濕盒中30 min，TBS沖洗。DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，梯度甲醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，并用NuanceTM多光譜進(jìn)行定量分析處理。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠COX-2的表達(dá)測(cè)定與正常組相比，NMDA組大鼠RGCL細(xì)胞有明顯棕黃色，即COX-2有表達(dá)；與NMDA組相比，NMDA+NS-398(10 ng·mL-1)組COX-2的表達(dá)顯著下調(diào)，而NMDA+NS-398(1 ng·mL-1)組和NMDA+NS-398(100 ng·mL-1)組COX-2的表達(dá)略有降低(圖1)。NMDA造模后COX-2的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)率為正常組的(315±11)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而給予NS-398(1 ng·mL-1、10 ng·mL-1和100 ng·mL-1)能夠抑制COX-2的表達(dá)，其低、中、高三種劑量組依次表達(dá)率分別為正常組的(280±20)%、(233±16)%、(255±19 )%(圖2)。

Figure 1 Expression of COX-2 in rat retinas of each group detected by immunohistochemical staining (×40). A: Control group; B: NMDA group; C: NMDA+1 ng·mL-1 NS-398 group; D: NMDA+10 ng·mL-1 NS-398 group; E: NMDA+100 ng·mL-1 NS-398 group 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜COX-2的表達(dá)(×40)。A：對(duì)照組；B：NMDA組；C：NMDA+1 ng·mL-1 NS-398組；D：NMDA+10 ng·mL-1 NS-398組；E：NMDA+100 ng·mL-1 NS-398組

Figure 2 Quantitative analysis of COX-2 expression in each group 各組大鼠視網(wǎng)膜COX-2的表達(dá)量

2.2各組大鼠caspase-3的表達(dá)測(cè)定與正常組相比，NMDA組大鼠RGCL細(xì)胞有明顯棕黃色，即caspase-3表達(dá)；與NMDA組相比，NMDA+NS-398(10 ng·mL-1)組RGCL細(xì)胞caspase-3陽性表達(dá)顯著降低，NMDA+NS-398(1 ng·mL-1)組RGCL細(xì)胞陽性表達(dá)也顯著降低，NMDA+NS-398(100 ng·mL-1)組RGCL細(xì)胞陽性表達(dá)略有降低(圖3)。多光譜定量結(jié)果表明： NMDA造模后caspase-3的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)率為正常組的(327±21)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而給予NS-398(1 ng·mL-1，10 ng·mL-1和100 ng·mL-1)能夠抑制caspase-3的表達(dá)，其低、中、高三種劑量組caspase-3表達(dá)率分別為正常組的(223±14)%、(197±18)%、(261±16)%(圖4)。

Figure 3 Expression of caspase-3 in rat retinas of each group detected by immunohistochemical staining (×40). A: Control group; B: NMDA group; C: NMDA+1 ng·mL-1 NS-398 group; D: NMDA+10 ng·mL-1 NS-398 group; E: NMDA+100 ng·mL-1 NS-398 group 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)(×40)。A：對(duì)照組；B：NMDA組；C：NMDA+1 ng·mL-1 NS-398組；D：NMDA+10 ng·mL-1 NS-398組；E：NMDA+100 ng·mL-1 NS-398組

2.3各組大鼠HE染色切片RGCL神經(jīng)元計(jì)數(shù)與正常組相比，NMDA組大鼠RGCL神經(jīng)元數(shù)目顯著減少；與NMDA組相比，NMDA+NS-398(10 ng·mL-1)組大鼠視網(wǎng)膜RGCL層神經(jīng)元數(shù)目顯著增加，且NMDA+NS-398(1 ng·mL-1)和NMDA+NS-398(100 ng·mL-1)組RGCL層神經(jīng)元數(shù)目也均有所增加(圖5)。同一倍率單位區(qū)域內(nèi)，NMDA組RGCL神經(jīng)元數(shù)目為正常組的(47±3)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而給予NS-398(1 ng·mL-1、10 ng·mL-1和100 ng·mL-1)能夠明顯改善RGCL神經(jīng)元丟失，其低、中、高三種劑量組RGCL神經(jīng)元的數(shù)目分別為正常組的(63±5)%、(82±7)%、(73±3)% (圖6)。

Figure 4 Quantitative analysis of caspase-3 expression in each group 各組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3表達(dá)的定量分析圖

2.4TUNEL法測(cè)定各組大鼠RGCL神經(jīng)元的凋亡與正常組相比，NMDA組的大鼠RGCL神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著增多；與NMDA組相比，NMDA+NS-398(10 ng·mL-1、100 ng·mL-1)組RGCL神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著降低，NMDA+NS-398(1 ng·mL-1)組神經(jīng)元凋亡數(shù)量略有降低(圖7)。NMDA組RGCL神經(jīng)元凋亡率為正常組的(200±8)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。而給予NS-398(1 ng·mL-1、10 ng·mL-1和100 ng·mL-1)能夠明顯抑制NMDA引起的RGCL神經(jīng)元凋亡，其低、中、高三種劑量組的RGCL細(xì)胞凋亡率分別為正常組的(142±20)%、(128±11)%、(149±15)% (圖8)。

Figure 5 HE staining of rat RGCL of each group (40×). A: Control group; B: NMDA group; C: NMDA+1 ng·mL-1 NS-398 group; D: NMDA+10 ng·mL-1 NS-398 group; E: NMDA+100 ng·mL-1 NS-398 group 各組大鼠RGCL HE染色(×40)。A：對(duì)照組；B：NMDA組；C：NMDA+1 ng·mL-1 NS-398組；D：NMDA+10 ng·mL-1 NS-398組；E：NMDA+100 ng·mL-1 NS-398組

Figure 6 Neuron numbers of RGCL in each group 各組大鼠RGCL神經(jīng)元計(jì)數(shù)

3 討論

視神經(jīng)是由RGC的軸突匯集組成，隨著神經(jīng)細(xì)胞的中毒、代謝障礙或血液循環(huán)障礙，可導(dǎo)致其軸突發(fā)生順行性潰變，RGC胞體的死亡必然造成其軸突的潰變，RGC與軸突數(shù)目間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系[9]。通過對(duì)單位長(zhǎng)度RGCL神經(jīng)元計(jì)數(shù)的分析，可以判斷NMDA所致?lián)p傷的嚴(yán)重程度及可能的通路[10]。光學(xué)顯微鏡下，HE染色后視網(wǎng)膜及視神經(jīng)清晰可見3個(gè)核層，由內(nèi)向外依次為RGC層、內(nèi)核層(INL)及外核層(ONL)。NMDA誘發(fā)的大鼠視網(wǎng)膜損傷，主要體現(xiàn)為RGCL神經(jīng)元數(shù)量減少[2]。RGCL層細(xì)胞一般為單層排列[11]，NMDA造模后，與正常對(duì)照組相比，NMDA組RGCL密度減小，細(xì)胞出現(xiàn)了丟失、無核現(xiàn)象，但3個(gè)核層及2個(gè)叢狀層仍然清晰可辯。

Figure 7 Apoptosis of rat RGCL of each group detected by TUNEL assay (×40). A: Control group; B: NMDA group; C: NMDA+1 ng·mL-1 NS-398 group; D: NMDA+10 ng·mL-1 NS-398 group; E: NMDA+100 ng·mL-1 NS-398 group TUNEL 法測(cè)定各組大鼠RGCL神經(jīng)元的凋亡(×40)。A：對(duì)照組；B：NMDA組；C：NMDA+1 ng·mL-1 NS-398組；D：NMDA+10 ng·mL-1 NS-398組；E：NMDA+100 ng·mL-1 NS-398組

Figure 8 Apoptotic rate of RGCL cell in each group 各組大鼠RGCL神經(jīng)元凋亡率

NS-398是COX-2的選擇性抑制劑，同時(shí)其具有一定的抗氧化作用，提示COX-2可能通過催化生成氧自由基從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織損傷[12]。氧自由基可與生物大分子，特別是細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸結(jié)合，形成脂質(zhì)過氧化物，破壞生物膜[13]。COX-2是誘導(dǎo)酶，在機(jī)體受到內(nèi)、外源性傷害性刺激后產(chǎn)生，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的前列腺素(prostaglandins,PG)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，誘發(fā)疼痛、炎癥和免疫細(xì)胞激活等。在傷害性刺激傳入引起痛及痛過敏時(shí)，COX-2表達(dá)上調(diào)；有資料顯示，COX-2表達(dá)的上調(diào)可能與 NMDA 受體的激活密切相關(guān)[14-15]。因而測(cè)定COX-2的表達(dá)可間接反映NMDA受體的激活程度，在一定程度上可反映組織細(xì)胞損傷的程度。正常情況下，caspase-3以休眠狀態(tài)的酶原形式存在于正常細(xì)胞中，凋亡信號(hào)啟動(dòng)后，caspase-9激活并切割caspase-3，使之轉(zhuǎn)化為具有酶催化作用的活性形式?；罨蟮腸aspase-3可以切割蛋白質(zhì)底物，包括細(xì)胞骨架蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的蛋白，參與DNA修復(fù)的酶如PARP、DNA-PKCS以及抗凋亡蛋白bcl-2等，最終引起細(xì)胞死亡[16-17]。因而測(cè)定caspase-3的表達(dá)可間接反映RGCL神經(jīng)元的凋亡情況。凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式，發(fā)生凋亡的細(xì)胞其DNA迅速被核酸酶降解，產(chǎn)生若干大小不一的寡核苷酸碎片。這種死亡過程沒有溶酶體及細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)含物不外泄，故不引起炎癥反應(yīng)及明顯的組織學(xué)改變，在光學(xué)顯微鏡下很難進(jìn)行鑒別，然而TUNEL技術(shù)的問世使這一問題得到了解決[18-19]。因此本研究運(yùn)用TUNEL法進(jìn)一步直接檢測(cè)RGCL神經(jīng)元的凋亡情況，并運(yùn)用NuanceTM多光譜顯微成像系統(tǒng)對(duì)caspase-3和TUNEL的結(jié)果進(jìn)行定量分析。

本研究通過對(duì)COX-2和caspase-3的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，給予NS-398有效地阻止了NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞組織的損傷。同時(shí)染色結(jié)果表明：NMDA誘導(dǎo)損傷后，大鼠RGCL神經(jīng)元數(shù)目嚴(yán)重減少。同NMDA誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷模型大鼠相比，給予COX-2

抑制劑NS-398能有效阻止NMDA誘導(dǎo)的大鼠RGCL神經(jīng)元數(shù)目減少，其可能是通過抑制大鼠RGCL神經(jīng)元凋亡途徑完成的；同時(shí)其caspase-3的表達(dá)明顯下調(diào)，表明大鼠RGCL神經(jīng)元的凋亡與凋亡蛋白caspase-3有關(guān)。本研究中，COX-2抑制劑NS-398對(duì)NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷的改善與COX-2的表達(dá)相關(guān)，但也很可能發(fā)揮了多靶點(diǎn)的整體協(xié)同效應(yīng)，其具體的機(jī)制尚不明確，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

1 張雪菲,崔浩,單飛雪.NO在缺血性視網(wǎng)膜病變機(jī)制的研究[J].中國(guó)實(shí)用眼科雜志,2003,21(6):474-477.

2 劉敏,王俊賢,李玉桑,宋一倩,藍(lán)麗萍,唐和斌.復(fù)方三芪提取物對(duì)NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(1):54-58.

3 韓太真,李延海.NMDA受體的結(jié)構(gòu)與藥理學(xué)特性[J].心理科學(xué)進(jìn)展,2008,16 (3):464-474.

4 溫恩懿,趙聰敏.選擇性COX-2抑制劑NS398干預(yù)后對(duì)HIBD新生大鼠海馬CA1區(qū)存活椎體細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2008,6(12):19-22.

5 任永欣,沈映君,曾南.紫蘇葉揮發(fā)油的抗炎機(jī)理研究—對(duì)花生四烯酸環(huán)氧酶代謝途徑的影響[C].第六次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)會(huì)議論文集,2002:185-190.

6 Yanni SE,McCollum GW,Penn JS.Genetic deletion of COX-2 diminishes VEGF production in mouse retinal Müller cells[J].ExpEyeRes,2010，91:34-41.

7 Takahashi H,Yanagi Y,Tamaki Y,Uchida S,Muranaka K.COX-2-selective inhibitor,etodolac,suppresses choroidal neovascularization in a mice model[J].BioBiophysicResCommuni,2004,325:461-466.

8 Janet C,Wayne R,Joseph T,Leigh Ann Claytonet,John C,Coenraad F,etal.Guide for the care and use of laboratory animals[M].8th ed.Washington(DC):National Academics Press,2011:1-220.

9 黃志堅(jiān).光動(dòng)力療法與光動(dòng)力療法聯(lián)合玻璃體腔注射貝伐珠單抗治療中心性滲出性脈絡(luò)視網(wǎng)膜病變的比較研究[J].中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志,2011,20(2):77-81.

10 Shi JM,Jiang YQ,Liu XY.Neur oprotective effects of erigeron breviscapus(vent)hand—mazz on NMDA-induced retinal neuron injury in the rats [J].InterJOphthalmol,2005,5(5):859-863.

11 宋劍濤,楊薇,廖品正.糖尿病黃斑病變研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)眼科雜志,2004,14(1):55-58.

12 常麗.新生大鼠缺氧缺血腦損傷ICEmRNA,COX-2蛋白的表達(dá)變化及COX-2抑制劑NS398的抗氧化作用[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2003.

13 汪云春,付鐵娟,趙智宇,夏陽,林淑香.亞低溫對(duì)大鼠局灶性腦缺血氧自由基和一氧化氮的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2007,5(27):991-993.

14 Li SQ,Xing YL,Chen WN,Yue SL,Li L,Li WB,etal.Activation of NMDA receptor is associated with Up-regulation of COX-2 expression in the spinal dorsal horn during nociceptive inputs in rats [J].NeurochemRes,2009,34(8):1451-1463.

15 邢艷麗.NMDA受體阻斷劑MK-801抑制大鼠甲醛炎性痛及痛過敏時(shí)脊髓后角COX-2蛋白及mRNA的表達(dá) [D].河北:河北醫(yī)科大學(xué),2008.

16 王宇卉,邵福源,夏春林,卞杰勇.大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型中caspase-3的表達(dá)[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2003,16(4):214-217.

17 Budihardjo I,OIiver H,Lutter M,Xu Luo,Wang XD.BiochemicaI pathways of caspase activation during apoptosis[J].AnnuRevCellDevBioi,1999,15(4):269.

18 Harrison DC,Davis RP,Bond BC,Campbell CA,James MF,Parsons AA,etal.Caspase mRNA expression in a rat model of focal cerebral ischemia[J].MolBrainRes,2001,89(6):133.

19 李愛軍,房軍,朱秀安,宮玉波,周瑾,彭小娟.白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑對(duì)遺傳性視網(wǎng)膜變性視細(xì)胞凋亡的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志,2013,31(1):23-27.

date：Sep 2,2013

National Natural Science Foundation of China (No:81202942); Research Fund of South-central University for Nationalities (No:XTZ10001，GCX12073)From theCollegeofPharmacy,South-centralUniversityforNationalities,Wuhan430074,HubeiProvince,China

Neuroprotective mechanism of cyclooxygenase-2 inhibitor on rat retinal ganglion cell layer neurons damage induced by N-methyl-D-aspartate

XU Lu,TIAN Han,LI Yu-Sang，YAO Guang-Qiang,TANG He-Bin,FENG Li-Jing,LIU Min

retina; n-methyl-D-aspartate; COX-2 inhibitor; apoptosis; neuroprotection

Objective To investigate the protection mechanisms of COX-2 inhibitor (NS398)on the rat retinal damage induced by n-methyl-D-aspartate (NMDA).Methods Twenty-five Sprague-Dawley rats were divided into five groups: control group, NMDA group and NMDA+NS-398 with different concentrations (1 ng·mL-1, 10 ng·mL-1, 100 ng·mL-1)group. Rats in the NMDA group were given 5 μL NMDA (40 nmol·L-1). Rats in NMDA+NS-398 with different concentration groups were given with an intravitreal injection (5 μL)of NMDA (40 nmol·L-1)and NS-398(1 ng·mL-1, 10 ng·mL-1, 100 ng·mL-1). Seven days after NMDA treatment, the eye tissues were taken from those rats. The neuron numbers of retinal ganglion cell layer (RGCL)were counted, the apoptosis of RGCL cell was determined by TUNEL assay, and the expressions of caspase-3 and COX-2 in the rats’ retinas were measured by immunohistochemical staining.Results Neuron numbers in RGCL of NMDA group+ low-, middle-, high- concentration NS-398 groups were greater (63%±5%, 82%±7%, 73%±3%of control, respectively)than that in NMDA group (47%±3% of control). The protein expressions of caspase-3 in the NMDA+ low-, middle-, high-concentration NS-398 groups were significantly lower (223%±14%, 197%±18%, 261%±16% of control, respectively)as compared with those in NMDA group (327%±21% of control). Also the expressions of COX-2 in the NMDA+low-, middle-, high-concentration NS-398 groups were significantly lower (280%±20%, 233%±16%, 255%±19%of control, respectively)as compared with NMDA group (315%±11% of control).Conclusion Inhibition of COX-2 can inhibit the NMDA-induced apoptosis of RGCL cells in the rats’ retina, which may have a protective effect on the retina.

徐露，女，1990年6月出生，湖北武漢人，碩士。聯(lián)系電話：13476851513；E-mail:hbtang2006@mail.scuec.edu.cn

AboutXULu:Female,born in June,1990.Master degree.Tel:13476851513; E-mail:hbtang2006 @mail.scuec.edu.cn

2013-09-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：81202942)；中南民族大學(xué)科研基金資助(編號(hào)：XTZ10001，GCX12073)

430074 湖北省武漢市，中南民族大學(xué)藥學(xué)院

劉敏，E-mail:liumin831016 @tom.com

徐露,田晗,李玉桑,姚光強(qiáng),唐和斌,奉黎靜,等.COX-2抑制劑對(duì)NMDA損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制研究[J].眼科新進(jìn)展,2014,34(4):301-305.

??

10.13389/j.cnki.rao.2014.0082

修回日期：2013-12-12

本文編輯：周志新

Accepteddate:Dec 12,2013

Responsibleauthor:LIU Min,E-mail:liumin831016@tom.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(4):301-305]