靶向腫瘤腺病毒介導IL-24抑制人胃癌細胞增殖

曹亞玲，黃茂濤，黃 一，季代金，馮早明，李學成，陳 陵

靶向腫瘤腺病毒介導IL-24抑制人胃癌細胞增殖

曹亞玲，黃茂濤，黃 一，季代金，馮早明，李學成，陳 陵

目的 探討人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子特異驅(qū)動IL-24的重組腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)對人胃癌SGC-7901細胞增殖及侵襲能力的影響。方法 將Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌SGC-7901細胞，采用熒光實時定量PCR及Western blot檢測IL-24表達；采用CCK-8方法檢測細胞生長曲線；采用Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。結(jié)果 與以PBS代替病毒液處理的SGC-7901細胞相比，感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901細胞內(nèi)IL-24 表達明顯升高(P<0.01)，于第5、6 d吸光度明顯下降(P<0.05)，細胞侵襲能力亦顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 Ad-phTERT-IL-24可有效上調(diào)人胃癌SGC-7901細胞IL-24表達，進而抑制細胞增殖及侵襲能力。

端粒酶；逆轉(zhuǎn)錄酶；啟動子；腺病毒；白細胞介素-24；胃癌

胃癌是發(fā)病率、致死率最高的腫瘤之一，多數(shù)患者確診時已是晚期，傳統(tǒng)手術、化療及放療療效欠佳[1]，亟需深入研究胃癌發(fā)病機制并開發(fā)新的治療模式[2]。IL-24是近年新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，具有多重抗腫瘤作用[3]。本課題在前期實驗中成功構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子特異驅(qū)動IL-24的復制缺陷型腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，本研究擬進一步采用Ad-phTERT-IL-24介導胃癌細胞內(nèi)IL-24過表達，探討IL-24對腫瘤細胞增殖及侵襲能力的影響，為進一步研究基于hTERT啟動子與IL-24的腫瘤靶向基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌SGC-7901細胞株(中科院上海生科院細胞資源中心)，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清及胰蛋白酶(美國HyClone公司)；hTERT啟動子特異驅(qū)動人IL-24的復制缺陷型腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，由本室構(gòu)建并保存；負載有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因LacZ 的復制缺陷型腺病毒，由西南醫(yī)院心內(nèi)科唐兵博士惠贈。Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(日本TAKARA公司)；CCK-8檢測試劑盒(碧云天)；膠原包被Transwell板(美國Corning公司)；M-PERTM蛋白提取試劑(美國Pierce公司)；小鼠抗人IL-24單克隆抗體、HRP標記兔抗小鼠二抗(英國Abcam公司)；ECL化學發(fā)光反應液(美國Thermo公司)；IL-24 PCR引物由上海生工合成純化，其上游序列P1：5'- CAGGAGGAACACGAGACTGA-3'；下游序列P2：5'- GCACAACCATCTGCATTTGAGA-3'，擴增片段長度120 bp[4]；內(nèi)參U6特異RT及real-time PCR引物套裝購自廣州銳博公司[5]；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國AB公司)；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計(美國Thermo公司)。

1.2 Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌細胞SGC-7901 采用含10%標準胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SGC-7901細胞。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，感染Ad-phTERT-IL-24病毒液。設空白對照組(加入PBS)和陰性對照組(Ad-LacZ)，腺病毒感染步驟參照文獻[6]進行。

1.3 RT-qPCR檢測IL-24的表達 取1.2步驟所得107個細胞，以200 g離心5 min，棄上清后加Trizol試劑1 ml，反復吹打。按照Trizol試劑說明書步驟提取總RNA，再將總RNA溶于DEPC水中，測定RNA濃度和純度。以U6管家基因做為內(nèi)參，設3個復孔。取總RNA 100 ng為模板，按照RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配20 μl反應體系，反應條件為42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；然后按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書，取4 μl cDNA為模板，配25 μl反應體系，預變性95 ℃ 30 s，反應40個循環(huán)，條件為95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s。采用2-△△Ct法進行結(jié)果分析，將不同標本的RQ值(RQ=2-△△Ct)進行比較?！鰿t=目的基因Ct值-內(nèi)參照基因Ct值，△△Ct=待測標本的△Ct-校正器△Ct。

1.4 Western blot檢測細胞內(nèi)IL-24的表達 按M-PERTM試劑盒說明書提取細胞總蛋白，SDS-PAGE 10%凝膠電泳，使用80 V進膠，140 V電泳至溴酚藍距下緣1 cm處終止。轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜。IL-24蛋白一抗以1∶200稀釋，室溫下孵育2 h。以1∶2000稀釋二抗，室溫下孵育2 h。加入ECL化學發(fā)光反應液，室溫1 min后成像，采用Image J軟件進行定量分析。

1.5 CCK-8方法檢測細胞增殖 待檢測細胞以每孔2.5×103個細胞接種于96孔板，每天檢測1次，共6 d，設5個復孔。檢測前每孔加入20 μl CCK-8，避光37 ℃孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長處吸光度(D)值。觀察IL-24對胃癌細胞增殖的影響并計算抑瘤率。抑瘤率=(1-T/C)×100%。

1.6 Transwell小室檢測胃癌細胞侵襲能力 感染腺病毒72 h后，收集細胞以無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋為1×105個/ml的細胞懸液，每孔加入200 μl于Transwell上室，下室加入800 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育24 h后，酒精棉球拭去上室細胞，以95%酒精固定后，1%結(jié)晶紫染色3 min。采用顯微鏡觀察細胞侵襲情況，每組設5復孔。結(jié)果統(tǒng)計：隨機取5個200倍視野，計數(shù)細胞后取平均值。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測各組細胞IL-24的表達 與PBS空白對照組比較，感染Ad-phTERT-IL-24后，SGC-7901細胞內(nèi)IL-24 mRNA表達豐度顯著上調(diào)(2.95±0.42 vs.0.93±0.07,P<0.01)；而Ad-LacZ感染SGC-7901細胞后，細胞內(nèi)IL-24 mRNA表達無明顯改變(1.18±0.17 vs.0.93±0.07,P>0.05)。

圖1 Western blot檢測各組細胞內(nèi)IL-24的表達

2.2 Western blot檢測各組細胞內(nèi)IL-24的表達 采用Ad-phTERT-IL-24感染hTERT陽性的人胃腺癌SGC-7901細胞后，借助Image J軟件進行定量分析可見，與PBS空白對照組相比，Ad-phTERT-IL-24組IL-24表達顯著上調(diào)(0.36±0.05 vs.0.06±0.02，P<0.01)，而Ad-Lac組則與PBS組近似(0.10±0.02 vs.0.06±0.02，P>0.05)，見圖1。

2.3 Ad-phTERT-IL-24抑制SGC-7901細胞增殖 將Ad-phTERT-IL-24及陰性對照Ad-Laz感染SGC-7901細胞24 h后，采用CCK-8檢測細胞生長曲線(圖2)。結(jié)果表明，與PBS空白對照組相比，感染了Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901實驗組細胞增殖受到明顯抑制。在第5、6 d，實驗組吸光度顯著減少(P<0.05)，而Ad-LacZ組與PBS組無顯著差異。Ad-phTERT-IL-24組第5、6 d抑瘤率分別為37.8%、36.5%。

圖2 CCK-8方法檢測各組SGC-7901細胞生長曲線與PBS組比較，①P<0.05

2.4 Ad-phTERT-IL-24抑制SGC-7901細胞侵襲能力 為進一步檢測Ad-phTERT-IL-24是否影響SGC-7901胃癌細胞的侵襲能力，采用Transwell侵襲實驗檢測了SGC-7901經(jīng)重組腺病毒Ad-phTERT-IL-24感染后的侵襲能力。與對照組相比，Ad-phTERT-IL-24實驗組細胞侵襲能力顯著下降(17.80±7.40 vs.34.20±7.22，P<0.05)，而Ad-LacZ組與PBS組無差著差異(37.80±12.09 vs.34.20±7.22，P>0.05)。

3 討論

已有文獻報道IL-24是一個抑瘤基因，對多種腫瘤有抑制作用，包括肺癌[7]、骨肉瘤細胞[8]、膠質(zhì)瘤[9]、肝癌[10]和胃癌等[11]。IL-24發(fā)揮抑瘤作用的機制，包括抑制增殖、誘導凋亡，增加腫瘤細胞對化療的敏感性，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等[12]。腫瘤的基因治療一方面需要選擇強效廣譜的治療基因，另一方面要盡量選擇具有腫瘤靶向性的載體[13]。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在幾乎所有胃癌組織中強陽性表達，而在正常組織中不表達或低表達[14]。以hTERT啟動子特異驅(qū)動治療基因是實現(xiàn)腫瘤靶向基因治療的較佳策略[15]。目前利用hTERT啟動子靶向腫瘤表達IL-24的重組腺病毒對胃癌的作用尚不明確。本研究采用在前期實驗中成功包裝的hTERT啟動子特異驅(qū)動IL-24重組腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，感染hTERT陽性的人胃腺癌SGC-7901細胞株，發(fā)現(xiàn)與PBS空白對照組相比，Ad-phTERT-IL-24可顯著上調(diào)SGC-7901細胞內(nèi)IL-24的表達水平(P<0.01)，無論是在mRNA水平還是蛋白水平，負載LacZ的腺病毒(Ad-LacZ)均與PBS組近似(P>0.05)，表明Ad-phTERT-IL-24上調(diào)SGC-7901細胞IL-24的表達，是由于其攜帶的靶基因IL-24所致，而非腺病毒感染引起。

進一步采用CCK8方法檢測IL-24對SGC-7901細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，感染Ad-phTERT-IL-24后，SGC-7901細胞增殖能力在第1～4 d抑制不明顯，但第5、6 d受到明顯抑制；而感染Ad-LacZ組始終與PBS組無明顯差異。表明采用Ad-phTERT-IL-24上調(diào)SGC-7901細胞內(nèi)IL-24表達水平，即可明顯抑制SGC-7901細胞增殖能力。在第1～4 d時，SGC-7901細胞未受到抑制，可能是因為腺病毒感染后，從DNA轉(zhuǎn)錄IL-24 mRNA進而翻譯IL-24蛋白，需要2～4 d的時間，并且，也需要IL-24表達達到一定強度才能發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。為進一步觀察IL-24對SGC-7901胃癌細胞侵襲能力的影響，本課題進行了Transwell小室侵襲實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901細胞的侵襲能力只有PBS組的一半(P<0.05)，而Ad-LacZ組與PBS組無顯著差異(P>0.05)。表明具有腫瘤靶向性同時負載IL-24的重組腺病毒Ad-phTERT-IL-24，可顯著抑制胃癌細胞的增殖及侵襲能力，在胃癌的基因靶向治療中具有潛在應用價值。

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Suppression of gastric cancer cell growth by tumor-targeted adenovirus mediated IL-24 gene

Cao Yaling1,Huang Maotao1,Huang Yi2,Ji Daijin1,Feng Zaoming1,Li Xuecheng3,Chen Ling2

1.Department of Digestion,Hospital 452 of PLA,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Department of Digestion,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China;3.Emei Sanatorium of Chengdu Military Command,Emeishan City,Sichuan,614200,China

Objective To discuss the effects of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)promoter targeted recombinant adenoviral vector carrying human IL-24 gene(Ad-phTERT-IL-24)on the proliferation and infestation ability of SGC-7901 human gastric cancer cells.Methods SGC-7901 tumor cells were infected by Ad-phTERT-IL-24.IL-24 expression level was examined by RT-qPCR and Western blot.CCK8 assay was used to detect the cell growth curve.Transwell camber infestation experiment was carried out to evaluate the invasion capability of SGC-7901 tumor cells.Results The expression of IL-24 in the SGC-7901 cells infected with Ad-phTERT-IL-24 significantly increased compared with the cells treated with PBS instead of virus liquid(P<0.01),the absorbance decreased significantly since the fifth and sixth day(P<0.05).Meanwhile the invasion ability also decreased significantly(P<0.05).Conclusion Ad-phTERT-IL-24 can effectively up-regulate the IL-24 expression and furthermore suppress the proliferation and invasion ability of human SGC-7901 gastric cancer cells.

telomerase;reverse transcriptase;promoter;adenovirus;IL-24;gastric cancer

國家自然科學基金資助課題(30900679)；重慶市集成示范計劃項目(cstc2013jcsf10014)；重慶市醫(yī)學科研計劃項目(2011-2-587)；四川省衛(wèi)生廳科研課題(110484)

610021 成都，解放軍452醫(yī)院消化內(nèi)科(曹亞玲，黃茂濤，季代金，馮早明)；解放軍324醫(yī)院消化內(nèi)科(黃 一，陳 陵)；成都軍區(qū)峨眉療養(yǎng)院(李學成)

陳 陵，E-mail:lingcong_008@126.com

R 739

A

1004-0188(2014)01-0009-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.004

2013-10-21)