參銀復智制劑中銀杏內(nèi)酯的提取分離檢測＊

王 琳，朱 纓，吳紀凱

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院，江蘇 蘇州 215009)

參銀復智制劑是正在研究中的一種用于治療血管性癡呆的 新型中藥復方制劑，其處方組成已向國家知識產(chǎn)權局申請發(fā)明專利。銀杏葉為組方中的君藥，具有多種生理活性，廣泛應用于心腦血管疾病和老年性癡呆的治療和癥狀改善。其主要有效成分之一為內(nèi)酯類化合物，包括銀杏內(nèi)酯(ginkgolide) 和白果內(nèi)酯(bilobalide)兩類。銀杏內(nèi)酯是二萜內(nèi)酯，根據(jù)所含羥基的數(shù)目和羥基連接位置的差異可分為A，B，C，M，J(ginkgolide A，B，C，M，J)5 種類型，這5 種銀杏內(nèi)酯均為血小板活化因子(PAF)強有力的拮抗劑，其中以銀杏內(nèi)酯B 的活性最強。白果內(nèi)酯(bilobalide)屬倍半萜內(nèi)酯，具有保護神經(jīng)的作用，對老年癡呆癥有良好的治療效果。本研究旨在尋找一種從銀杏葉中提取、分離、檢測銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯且快速簡便、適用于大生產(chǎn)的方法，為參銀復智制劑的研制提供幫助，也為制備銀杏葉提取物的研究提供參考。

1 儀器與試藥

液相色譜儀為Waters Acquity UPLC system，包括二元泵處理器、樣品處理器、柱溫箱、ELSD 檢測器以及Empower 色譜工作站;W14M-2 型電子恒溫水浴鍋(sheldon manufacturing.Inc. );RE200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士);ZK-2A 型真空干燥器(上海實驗儀器廠);CP225D 型電子天平(Sartorius 公司);PB-10 型酸度計(Sartorius);搖床(Labnet orbit LS)。大孔吸附樹酯D101，AB-8，D201 及聚酰胺樹脂均為工業(yè)級;乙腈為色譜純(Merck 公司)，其他試劑均為分析純;水為Millipore 超純水。銀杏葉藥材由蘇州天靈中藥飲片公司提供;銀杏葉內(nèi)酯A(GA)、銀杏葉內(nèi)酯B(GB)、銀杏葉內(nèi)酯C(GC)和白果內(nèi)酯(BB)對照品購至Sigma 公司，純度均大于98%。

2 方法與結果

2.1 銀杏萜類內(nèi)酯含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相:甲醇-四氫呋喃-水(25 ∶5 ∶70);流速:0.3 mL/min;柱溫:30 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD):漂移管溫度80 ℃，載氣為氮氣，流速2.5 L/min;進樣量:5 μL。

2.1.2 線性關系考察

取GA，GB，GC，BB 對照品適量，甲醇溶解，精密吸取混合對照品溶液適量，分別配制成不同質(zhì)量濃度，按擬訂色譜條件依次進樣，分別重復3 次。以峰面積積分值(Y)為縱坐標、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.1.3 供試品溶液制備及測定

根據(jù)前期正交試驗結果及文獻[1]報道，選擇以下方法提取銀杏葉內(nèi)的內(nèi)酯類成分:銀杏葉適當粉碎，加入7 倍量70%乙醇回流提取2 次，每次3 h，合并提取液，減壓回收乙醇，加適量水至3 倍藥材量水沉，靜置，過濾，濃縮至一定體積，濃縮液低溫貯存待用。分別吸取等量濃縮液按1 BV/h 的流速上不同類型樹脂柱吸附，先用水洗2 h，取一定濃度的乙醇，按1 BV/h 的流速洗脫，分別收集1 個柱床體積的洗脫液，減壓濃縮后以甲醇定容，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。按擬訂方法測定含量，超高效液相色譜圖見圖1。

2.2 銀杏萜類內(nèi)酯分離工藝研究

圖1 超高效液相色譜圖

吸附樹脂的吸附性能與被吸附分子的極性、分子大小，以及吸附劑的極性、比表面積、孔徑大小等因素有關，且因結構和基團不同或生產(chǎn)廠家不同，吸附樹脂的吸附能力也有所區(qū)別。為了分離、富集、純化銀杏葉中的萜類內(nèi)酯，收集了部分國內(nèi)不同廠家、不同型號的吸附樹脂，通過對銀杏葉萜類內(nèi)酯的吸附與分離性能的研究，篩選出較理想的樹脂和分離工藝。

大孔吸附樹脂預處理:在吸附樹脂生產(chǎn)過程中一般均采用工業(yè)級原料，產(chǎn)品沒有經(jīng)過進一步凈化處理，故吸附樹脂內(nèi)部往往殘留少量單體、致孔劑和其他有機物雜質(zhì)，產(chǎn)品貯存期間為防止細菌、霉菌的生長，有時會加入堿等防腐劑[2]。因此，在樹脂使用之前，必須進行預處理，以除去制備和貯存中引入的雜質(zhì)。一般預處理方法，先是吸附樹脂水合(吸附樹脂通常以濕態(tài)保存，若暴露在空氣中則可能部分干燥失水)，為使樹脂再度水合，應把脫水的吸附樹脂充分浸泡，以便從孔中趕出空氣泡;浸泡之后，用水沖洗取代乙醇，水洗可除去痕量的防腐劑和殘留的單體化臺物。

大孔吸附樹脂再生:當樹脂的吸附能力降低或受嚴重污染時需對樹脂進行強化再生。在容器內(nèi)加入高于樹脂層10 cm 的3% ～5%鹽酸溶液浸泡2 ～4 h，然后進行二次水淋洗，至pH 接近中性;再用3 ～4 倍樹脂體積同濃度的鹽酸溶液通柱，然后用二次水洗至接近中性;用3% ～5%的氫氧化鈉溶液浸泡4 h，后用二次水清洗至pH 為中性，備用即可。取一定量的樹脂，用95%的乙醇浸泡24 h，后用乙醇洗滌，直到洗出液中加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗至無醇;然后依次用4%NaOH、5%HCL 浸泡2 ～4 h，分別用蒸餾水洗至中性，備用。

吸附樹脂裝柱步驟:一般吸附柱由玻璃制成。在裝柱之前應先在柱中加入一定量的水，然后將帶水的吸附樹脂漿液倒入柱中，一般按下列步驟進行:樹脂-水漿液加入已帶有定量水的吸附柱中;把過量的水通過柱底放出，保持水面高于樹脂層面3 cm以上，直到所有樹脂全部轉(zhuǎn)移到柱中。

吸附樹脂選擇:分別稱取3 g 處理好的AB-8，D101，D201及聚酰胺4 種干大孔樹脂，置100 mL 具塞三角瓶中，量取銀杏葉提取濃縮液50 mL，置恒溫搖床中，25 ℃下以一定的速率振搖24 h后進行過濾，參照2.1 項下方法制備供試品溶液并測定GA，GB，GC，BB 的峰面積，代入相應的線性回歸方程計算吸附平衡后溶液中銀杏內(nèi)酯的質(zhì)量濃度，計算吸附量，吸附量= ( C0- C) × V/m(mg/g)。將吸附平衡的樹脂立即放入磨口三角瓶中，精確加入15%乙醇，振蕩24 h，再將樹脂濾出，測定洗脫液中GA，GB，GC，BB的質(zhì)量濃度，計算解吸率，解吸率= [ V1C1/( C0- C) V] ×100%。其中，C0和C 分別為樹脂吸附前后銀杏內(nèi)酯粗提物液中各萜類銀杏內(nèi)酯的質(zhì)量濃度，C1為15%乙醇解吸附后溶液中各萜類銀杏內(nèi)酯的質(zhì)量濃度，V 為銀杏內(nèi)酯粗提物液的體積(50 mL)，V1為洗脫液體積(200 mL)，m 為干樹脂質(zhì)量(3 g)。測定結果見表2?？梢?，聚酰胺吸附樹脂對銀杏葉中萜類內(nèi)酯有較好的吸附作用，加之較高的解吸率(達90%以上)，能起到對銀杏葉中內(nèi)酯類物質(zhì)的富集純化作用。因此，選用聚酰胺吸附樹脂進行銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)的動態(tài)吸附試驗。

表2 4 種大孔樹脂對銀杏葉萜類內(nèi)酯的靜態(tài)吸附效果比較

洗脫劑及洗脫濃度選擇:內(nèi)酯類化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶劑，考慮到甲醇的毒性和丙酮的揮發(fā)性及溶解性，本試驗中采用乙醇-水為洗脫溶劑，對已吸附的樹脂按1 BV/h 的流速上柱吸附，先用水洗2 h，再用不同濃度洗脫劑自上而下進行洗脫，分別收集不同濃度洗脫劑的洗脫液，真空干燥，測定萜類內(nèi)酯的總含量(GA，GB，GC，BB 含量之和)。結果見圖2。可見，乙醇濃度在5% ～10%之間基本上可將內(nèi)酯洗脫下來，而銀杏萜類內(nèi)酯有效部位的含量高，考慮到用5%乙醇洗脫時需較大體積，故采用10%乙醇為洗脫溶劑。

圖2 不同濃度洗脫劑的洗脫曲線

洗脫劑用量選擇:考慮到洗脫劑對分離效果的影響，分別對10%的乙醇濃度，以1，2，3，4，5 BV 的流速進行試驗。結果見表3。從理論上講，洗脫劑用量越多越好，但過量的洗脫劑后處理較麻煩，起不到濃縮效果，且過量的溶劑會將銀杏葉內(nèi)的其他成分洗脫下來，從而降低銀杏萜類內(nèi)酯的純度。由表3 可知，2 ～3 倍的洗脫劑用量已能將內(nèi)酯洗脫下來。

2.3 最佳分離工藝條件驗證

上述試驗確定的最佳工藝條件為，銀杏葉采用7 倍70%乙醇回流提取2 次，每次3 h，合并提取液，減壓回收乙醇，加3 倍量水，水沉，過濾，濃縮，然后上已處理好的聚酰胺樹脂，2 倍水洗后，用2 ～3 倍樹脂床體積的10%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮干燥。按此條件試制3 批樣品，檢測含量。結果銀杏萜類內(nèi)酯的含量都在35%以上，有效部位得率在90%以上，與所用銀杏葉原料中有效成分含量成正相關。因此，該工藝技術穩(wěn)定可靠，能較經(jīng)濟地達到有效分離銀杏萜內(nèi)酯的目的。

表3 洗脫劑用量對洗脫效果的影響

3 討論

與高效液相色譜(HPLC)法比較，超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(UPLC-ELSD)法在檢測銀杏葉萜類內(nèi)酯時具有超高分離度、超高速度、超高靈敏度等優(yōu)點[3]。常規(guī)HPLC 法測定銀杏中萜類內(nèi)酯的含量一般需要0.5 ～1 h，樣品組分才能得到較好的分離，而采用UPLC 法只需15 min 就能得到更好的分離效果和分析結果。本試驗中只采用一次柱分離、結晶純化，即可連續(xù)制得純度達35%以上的銀杏萜類內(nèi)酯。本工藝操作中，只采用無毒試劑水和乙醇，對產(chǎn)品藥用提供了安全保障。由于采用的是可重復使用的大孔樹脂，使生產(chǎn)成本大大降低，且工藝簡便，采用有機試劑少，因此適用于中試及工業(yè)生產(chǎn)，且為大規(guī)模開發(fā)銀杏萜內(nèi)酯藥品奠定了良好的基礎。

[1] 陳 紅，孫黎清，董自波. 銀杏葉總黃酮苷和萜內(nèi)酯類化合物最佳提取工藝研究[J]. 中國藥業(yè)，2007，16(14):47 -48.

[2] 蘇 靜，談 鋒，李連強，等. 高速逆流色譜法分離純化銀杏葉中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C[J]. 中草藥，2008，39(11):1 644 -1 648.

[3] 趙一懿，郭洪祝，王京輝，等. 超高效液相色譜法同時測定銀杏葉提取物中11 種黃酮苷類成分的含量[J]. 中國藥學雜志，47(24):2 032 -2 037.