可斷裂聚乙二醇和穿膜肽共修飾脂質(zhì)體腫瘤靶向作用初步研究

石志蓉，肖羽君

(1. 廣東省珠海市第二人民醫(yī)院藥劑科，廣東 珠海 519070; 2. 聯(lián)邦制藥有限公司中山分公司，廣東 中山 528400)

腫瘤是目前全球致死率排名第2 的疾病，目前臨床的主要治療方法有化學(xué)治療(簡(jiǎn)稱化療)、手術(shù)、放射治療(簡(jiǎn)稱放療)、中藥、免疫、分子靶向等?；熓桥R床應(yīng)用最廣泛的治療手段，但全身不良反應(yīng)較明顯，給患者造成了較大痛苦[1]。20 世紀(jì)初，部分學(xué)者對(duì)藥物靶向治療展開了研究，有望進(jìn)行選擇性給藥，對(duì)于提高治療效果、降低不良反應(yīng)均有重要意義。其中，脂質(zhì)體以其疏水、親水雙構(gòu)造特性在許多疾病的治療中受到了廣泛關(guān)注[2]。筆者探討了可斷裂藥用聚乙二醇(PEG)和穿膜肽(TAT)共修飾脂質(zhì)體用于腫瘤靶向治療的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑包括大豆卵磷脂、膽固醇、1640 培養(yǎng)基、TritonX-100、Sephadex-G50、胎牛血清、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、牛血清白蛋白等，均購自專業(yè)生產(chǎn)廠家。脂質(zhì)體制備設(shè)備為ZHWY-100H型恒溫空氣搖床、RE-200B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋、AL204-IC 型電子天平、超聲細(xì)胞粉碎機(jī)等，檢測(cè)觀察設(shè)備為RF-5301 型熒光分光光度計(jì)、Sizer Nano ZS90 型激光粒度儀、ZETA 電位分析儀、倒置熒光顯微鏡、Agilent 6410 型質(zhì)譜儀、HPLC/LC/24-AD 型高效液相色譜儀、ELX800 型酶標(biāo)儀等。

1.2 脂質(zhì)體制備

脂質(zhì)體制備采用薄膜分散-超聲法。取SPC，CHo，DSPEPEG-TAT，DSPE-PEG-OMe 等，劑量參照文獻(xiàn)[3]。將上述藥劑置50 mL 茄型瓶中，加入氯仿進(jìn)行溶解，旋轉(zhuǎn)、蒸發(fā)后置真空干燥器中，24 h 后加入pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)2.5 mL，并將所得物質(zhì)置入37 ℃恒溫空氣搖床中，以180 r/min 的速率離心20 min 后，水化10 min，水浴超聲脫膜5 min，并使用超聲探頭(80W)掃描15 次，每次5 min，即得所需可斷裂PEG 和TAT 共修飾脂質(zhì)體。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 質(zhì)譜鑒定

使用LA-24AD 型高效液相色譜儀進(jìn)行粗分離，使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法檢測(cè)純度后，收集主峰，參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。鑒定參數(shù):曲形脫溶劑裝置(CDL)250 ℃;電壓:檢測(cè)器1.5 kV，探針4.5 kV，CDL-20 V;流速:霧化器1.5 L/min;流動(dòng)相:0.2 mL/min;全掃描質(zhì)量范圍:400 ～1 500 m/z。

1.3.2 體外活性

取SMMC-7721 人肝癌細(xì)胞株及LO2 人正常肝細(xì)胞株，分別納入觀察組及對(duì)照組，均將其培養(yǎng)至90%匯合后，使用PBS 漂洗2 次，接種于12 孔板，接種密度為5×104個(gè)/孔，每孔再加入DMEM(含共修飾脂質(zhì)體100 μg /mL)，孵育3 h 后用PBS 漂洗5次，加入4%多甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，觀察其體外活性。

1.3.3 細(xì)胞生物學(xué)活性

將SMMC-7721 人肝癌細(xì)胞株接種于12 孔板，接種密度為5 ×103個(gè)/孔，培養(yǎng)12 h 后，分別向各孔加入共修飾脂質(zhì)體，質(zhì)量濃度依次為0，20，40，80，100，120，140，160，180 μg/mL，用酶標(biāo)儀觀察各質(zhì)量濃度溶液490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(D490)[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定，合成的共修飾脂質(zhì)體雜質(zhì)較少，其相對(duì)分子質(zhì)量約為3 622.4，純度約為96.1%，圖像表現(xiàn)為主峰峰面積較高，見圖1。

2.2 體外活性觀察結(jié)果

白色光、熒光及重疊后，觀察組均可見胞內(nèi)紅色細(xì)胞大量分布，且集中于胞質(zhì)內(nèi)。見圖2。

圖1 共修飾脂質(zhì)體高效液相色譜圖

圖2 共修飾脂質(zhì)體的體外活性

2.3 細(xì)胞生物學(xué)活性觀察結(jié)果

不同質(zhì)量濃度共修飾脂質(zhì)體對(duì)SMMC-7721 的細(xì)胞生物學(xué)活性影響與對(duì)照組比較，無明顯差異，見表1。

表1 共修飾脂質(zhì)體對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞生物學(xué)活性的影響(± s)

表1 共修飾脂質(zhì)體對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞生物學(xué)活性的影響(± s)

組別對(duì)照組觀察組質(zhì)量濃度(μg/mL)0 20 40 60 80 D490 D490 0.210 70±0.017 64 0.023 51±0.019 50 0.023 28±0.003 98 0.230 90±0.015 34 0.214 80±0.025 88組別觀察組質(zhì)量濃度(μg/mL)100 120 140 160 180 0.238 10±0.039 08 0.024 09±0.001 97 0.023 50±0.016 30 0.023 59±0.011 94 0.229 80±0.013 85

3 討論

臨床腫瘤治療最常見的手段是化療，但多種化療藥物在消滅腫瘤細(xì)胞時(shí)對(duì)患者正常細(xì)胞也造成了極大損害，常引發(fā)骨髓抑制、免疫下降甚至心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)毒性，使患者治療耐受性大幅下降，影響了治療依從性及治療效果[6]。因此，尋找合適的脂質(zhì)體攜帶藥物到達(dá)腫瘤位置進(jìn)行靶向治療一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。

筆者參考在前人研究的基礎(chǔ)上制備了可斷裂PEG 和TAT 共修飾脂質(zhì)體，其依據(jù)主要為:可斷裂PEG 能夠使脂質(zhì)體的作用時(shí)間延長(zhǎng)，且能夠幫助其越過網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬環(huán)節(jié)，并增強(qiáng)攜帶藥物的滲透作用，具有較佳的腫瘤靶向性;TAT 又稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，具有親水、疏水兩端，能夠促進(jìn)藥物的細(xì)胞內(nèi)攝取;PEG 對(duì)脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞的作用存在影響，同時(shí)，TAT 選擇特異性較差，不利于其在腫瘤內(nèi)的長(zhǎng)期蓄積[7]。因此，將可斷裂PEG 及TAT 制備為共修飾脂質(zhì)體，有望達(dá)到協(xié)同作用的目的，發(fā)揮二者的優(yōu)勢(shì)。

由質(zhì)譜鑒定結(jié)果可見，合成的共修飾脂質(zhì)體雜質(zhì)較少，其相對(duì)分子質(zhì)量約為3 622.4，純度約為96.1%，提示可斷裂PEG 和TAT 合成純化效果十分明顯，與預(yù)期理論相對(duì)分子質(zhì)量3 622.37無明顯差異，合成效果理想。體外活性觀察可見，白色光、熒光及重疊后觀察組均可見胞內(nèi)紅色細(xì)胞大量分布，且集中于胞質(zhì)內(nèi)，這表明共修飾脂質(zhì)體具有較佳的體外活性，即共修飾脂質(zhì)體可選擇性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，而不會(huì)進(jìn)入正常細(xì)胞株，顯示了其良好的細(xì)胞靶向性[8]，且合成的共修飾脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后多集中于細(xì)胞質(zhì)位置，有利于靶向藥物作用的發(fā)揮，具有良好的臨床應(yīng)用前景。為進(jìn)一步分析該共修飾脂質(zhì)體的安全性，筆者對(duì)靶向細(xì)胞活性的變化進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度共修飾脂質(zhì)體對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞生物學(xué)活性與對(duì)照組比較無明顯差異，提示共修飾脂質(zhì)體的質(zhì)量濃度不會(huì)影響細(xì)胞的活性，不會(huì)引發(fā)細(xì)胞活性改變，進(jìn)而有效地防止了細(xì)胞毒性反應(yīng)的發(fā)生[9]，具有良好的安全性。此外，Cole 等[10]指出，可斷裂PEG 能促進(jìn)共修飾脂質(zhì)體通過正常毛細(xì)血管壁，減少了攜帶藥物在其他非靶向部位的分布。這也大大降低了藥品不良反應(yīng)的發(fā)生率，且在保護(hù)心肌方面作用最顯著[11-13]。

綜上所述，可斷裂PEG 和TAT 共修飾脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較高，制備工藝便捷，具備良好的藥物承載性和安全性，且存在良好的細(xì)胞內(nèi)外傳遞潛能，腫瘤靶向性極佳，具有良好的臨床應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究。

[1] Danhier F，F(xiàn)eron O，Préat V.To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery[J]. Journal of Controlled Release，2010，148(2):135 -146.

[2] 王蔚芹，張振海，周建平，等. 用于腫瘤靶向治療與診斷的糖結(jié)合物研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(12):1 763 -1 770.

[3] 吳美霖，王 飛，黃 園，等.LyP-1 修飾的腫瘤靶向脂質(zhì)體制備及抗腫瘤活性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44(7):694 -701.

[4] Wu XL，Kim JH，Koo H，et al.Tumor-targeting peptide conjugated pHresponsive micelles as a potential drug carrier for cancer therapy[J]. Bioconjugate Chemistry，2010，21(2):208 -213.

[5] 沈 敏，鞏發(fā)明，朱康順，等. 多功能靶向納米載體的制備及其對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的靶向性和MRI 示蹤性觀察[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2012，28(6):1 031 -1 035.

[6] Ruoslahti E，Bhatia SN，Sailor MJ. Targeting of drugs and nanoparticles to tumors[J].The Journal of Cell Biology，2010，188(6):759 -768.

[7] Cole AJ，David AE，Wang J，et al.Magnetic brain tumor targeting and biodistribution of long-circulating PEG-modified， cross-linked starch-coated iron oxide nanoparticles[J]. Biomaterials，2011，32(26):6 291 -6 301.

[8] 曾永秋，曹 洋，余 紅，等. Survivin 啟動(dòng)子調(diào)控的hTERT 基因RNAi 載體的構(gòu)建及其腫瘤靶向干擾作用研究[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，36(4):350 -355.

[9] 王毅剛，何凌峰，何國(guó)清，等. 腫瘤靶向腺相關(guān)病毒攜帶干擾素β 和TRAIL 對(duì)A549 肺癌移植瘤的增強(qiáng)治療效應(yīng)[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2010，26(6):780 -788.

[10] Cole AJ，David AE，Wang J，et al.Polyethylene glycol modified，crosslinked starch-coated iron oxide nanoparticles for enhanced magnetic tumor targeting[J].Biomaterials，2011，32(8):2 183 -2 193.

[11] 王翠艷，梁秀敏，李占山. 干擾素-γ 免疫脂質(zhì)體靶向治療大鼠小細(xì)胞肺癌的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)藥業(yè)，2013，22(5):10 -11.

[12] Gurudevan S，Kanwar RK，Veedu RN，et al.Targeted Multimodal Liposomes for Nano-delivery and Imaging: An Avenger for Drug Resistance and Cancer[J].Curr Gene Ther，2013，13(5):322 -334.

[13] 趙 敏. 米非司酮脂質(zhì)體的制備及性質(zhì)考察[J]. 中國(guó)藥業(yè)，2009，18(13):34 -35.