波長(zhǎng)切換高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化胃舒顆粒中4 種有效成分的含量＊

尤獻(xiàn)民，鄒桂欣，邸子真

(遼寧省中醫(yī)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

化胃舒顆粒由黃芪、人參、法半夏、當(dāng)歸、陳皮、甘草等13 味中藥組方，具有益氣養(yǎng)陰、和胃降逆之功效，臨床用于治療癌癥患者使用化學(xué)治療藥物損傷脾胃造成的食欲不振、腹脹、惡心、嘔吐等癥。方中黃芪具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，甘草具有抗炎、抗?jié)兊淖饔?，?dāng)歸具有補(bǔ)血活血、提高機(jī)體免疫力的作用，陳皮具有促進(jìn)消化、解痙等作用，均為處方中主要藥效組分。曾有文獻(xiàn)報(bào)道了化胃舒顆粒中黃芪甲苷和人參總皂苷的含量測(cè)定[1-3]，但多組分同時(shí)測(cè)定還未見(jiàn)報(bào)道。筆者建立了反相高效液相色譜波長(zhǎng)切換法，測(cè)定化胃舒顆粒中毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷4 種成分的含量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，為該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100 型高效液相色譜儀;DAD 二級(jí)管陣列檢測(cè)器(美國(guó));8453A 型紫外分光光度計(jì)(日本島津);KQ-250DB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA1004 型萬(wàn)分之一電子分析天平(上海上天精密儀器有限公司);SHB Ⅲ型循環(huán)水式真空泵(鄭州長(zhǎng)城公貿(mào)有限公司)?；甘骖w粒(遼寧富東制藥有限公司，規(guī)格為每袋10 g，批號(hào)為11112401，11112402，11112403)，毛蕊異黃酮苷對(duì)照品(批號(hào)為111920-201203)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào)為111610-201001)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)為110773 -201012)、橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)為110721-200613)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;乙腈(色譜純，Dikma technologles inc.lot，批號(hào)為70151)，磷酸(色譜純，Tedia compant，inc.lot，批號(hào)為807230)，乙醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20130206)，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Synergi C18柱(25 mm×4.6 mm，4 μm);流動(dòng)相:體積分?jǐn)?shù)為0.05%的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0 ～25 min時(shí)體積分?jǐn)?shù)為17%的B，25 ～40 min 時(shí)體積分?jǐn)?shù)為17%→20%的B，40 ～50 min 時(shí)體積分?jǐn)?shù)為20%的B，50 ～60 min 時(shí)體積分?jǐn)?shù)為50%→80%的B;流速:1 mL /min;檢測(cè)波長(zhǎng):0 ～19 min、260 nm，19 ～22 min、237 nm，22 ～25 min、316 nm，25 ～40 min、280 nm;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取4 種對(duì)照品適量，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成各對(duì)照品貯備液。精密量取毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸和橙皮苷對(duì)照品溶液適量，置同一25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為17.51，17.09，16.32，24.72 μg/L 的對(duì)照品混合溶液。取化胃舒顆粒50 g，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%的乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，備用，即得供試品溶液。按處方比例稱取化胃舒顆粒中缺黃芪、缺甘草、缺當(dāng)歸和缺陳皮藥材及缺4 味藥材的其他藥材，按供試品溶液制備方法制備各陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

檢測(cè)波長(zhǎng)確定:分別吸取4 種對(duì)照品溶液各適量，在紫外分光度計(jì)200 ～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果毛蕊異黃酮苷在260 nm 附近有最大吸收，甘草苷在237 nm 附近有最大吸收，阿魏酸在316 nm 附近有最大吸收，橙皮苷在280 nm 附近有最大吸收。如果采用單一波長(zhǎng)測(cè)定，不能使每個(gè)組分都在最適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定。采用高效液相色譜程序切換波長(zhǎng)技術(shù)，可根據(jù)各組分的出峰順序，在不同時(shí)間段分別用其相應(yīng)組分的最大吸收波長(zhǎng)(檢測(cè)波長(zhǎng):0 ～19 min，260 nm;19 ～22 min，237 nm;22 ～25 min，316 nm;25 ～40 min，280 nm)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高各成分檢測(cè)靈敏度，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

專屬性考察:在擬訂色譜條件下，毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸和橙皮苷色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，對(duì)稱因子均在0.95 ～1.05，理論板數(shù)分別不低于5 000，3 000，4 000，4 000。陰性對(duì)照品溶液對(duì)毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷的測(cè)定無(wú)干擾，方法專屬性良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:依次精密吸取混合對(duì)照品溶液5，10，15，20，25 μL，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)、對(duì)照品峰面積A 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程毛蕊異黃酮苷為A =3 119.4 C -10.1(r =1，n =5)，甘草苷為A =970.16 C -9.3(r =0.999 8，n =5)，阿魏酸為A =1 861.5 C-20.5(r=0.999 9，n=5)，橙皮苷為A=1 141.6 C-10.7 (r=0.999 8，n=5)。結(jié)果表明，進(jìn)樣量毛蕊異黃酮苷在0.087 5 ～0.437 8 μg 范圍內(nèi)、甘草苷在0.085 45 ～0.427 3 μg 范圍內(nèi)、阿魏酸在0.081 6 ～0.408 μg 范圍內(nèi)、橙皮苷在0.123 5 ～0.618 μg 內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取混合對(duì)照品溶液，在擬訂色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次20 μL。結(jié)果毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸和橙皮苷的峰面積RSD 分別為1.5%，1.1%，1.2%和1.0%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取樣品2 g，依法制備供試品溶液，平行6 份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷含量的RSD 分別為1.1%，1.2%，1.5%，1.3%，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于室溫放置2，4，8，12，24 h 時(shí)，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷色譜峰面積的 RSD 分別為1.3% ，1.2%，1.6%，1.4%，表明供試溶液室溫下放置24 h 各待測(cè)組分穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的供試品，平行9 份，每份1 g，精密稱定，分別加入低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批化胃舒顆粒，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，采用外標(biāo)點(diǎn)法計(jì)算毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

供試品溶液制備時(shí)，曾分別采用50%乙醇及70%乙醇進(jìn)行超聲和回流提取，結(jié)果用50%乙醇與70%乙醇提取，4 種有效成分含量相差無(wú)幾，但用50%乙醇提取時(shí)色譜峰峰形好于70%乙醇，因此確定用50%乙醇。在進(jìn)行超聲提取與回流提取的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，回流提取時(shí)橙皮苷的含量高于超聲提取，其他3 種成分無(wú)明顯差異，因此確定采用回流提取法制備供試品溶液。

參照文獻(xiàn)報(bào)道，以多種流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)4 組分進(jìn)行分離，結(jié)果表明在甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)中，甘草苷與阿魏酸色譜峰保留時(shí)間接近，分離度小于1.5，改用乙腈-水及乙腈-磷酸水梯度洗脫系統(tǒng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)水相中加入少量的磷酸可使色譜峰及分離度得到改善，但隨著磷酸含量增加，基線向上漂移，最終確定水相采用0.05%磷酸水溶液，可使4 組分有較好地分離;研究中曾采用不同填料的色譜柱，如Synergi C18柱、Zobax-DB C18柱及Hpersil C18柱進(jìn)行分析，均得到了良好結(jié)果，提示本方法有良好的適用性。

本研究采用波長(zhǎng)切換技術(shù)[4]，成功建立了同時(shí)測(cè)定化胃舒顆粒中蕊異黃酮苷、阿魏酸、甘草苷和橙皮苷含量的反相高效液相色譜法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可為該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)。

表1 毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸和橙皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n=9)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果( n=3)

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