應用響應面分析優(yōu)化酶法輔助超聲提取余甘子多糖工藝

羅 蘭，曾茂貴，饒雪娥，李羚羚

(1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院藥學系，福建 福州350101;2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003)

余甘子(Phyllanthi fructus)是大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬(Phyllanthus)植物余甘子(P. emblica L.)的成熟果實。余甘子味甘、酸、澀，性涼，具有清熱涼血、消食健胃和生津止渴的功效，可用于血熱血瘀、消化不良腹脹、咳嗽、喉痛和口干等［1］，是衛(wèi)生部頒布的藥食兼用品種。余甘子主要的活性成分包括鞣質、黃酮和多糖［2-6］。余甘子各器官皆含有豐富的多糖類化合物，尤其是鮮果肉含量最高［7］。而植物多糖具有多種生物活性，如清除自由基、抗氧化和抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低血脂和血糖［8］。福建閩南地區(qū)盛產(chǎn)余甘子，因此開展余甘子多糖的提取工藝研究具有實際應用價值。

響應面分析法(response surface analysis，RSA)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學統(tǒng)計方法。采用二次回歸方程擬合因素和響應值之間的函數(shù)關系，解決多變量問題建立數(shù)學模型從而得到最佳工藝參數(shù)，具有試驗次數(shù)少、周期短、求得的回歸方程精度高，且能研究幾種因素間交互作用等諸多優(yōu)點［9］。本文利用超聲波法［10］和酶解法［11］的協(xié)同作用，以多糖提取率為指標，采用酶法輔助超聲提取，通過響應面分析確定余甘子多糖的最佳提取工藝，為余甘子應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 余甘子 采購于福建省惠安縣紫山鎮(zhèn)，由福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院中藥教研室朱扶蓉副教授鑒定。

1.1.2 設備 T6 新世紀紫外—可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);葡萄糖對照品(批號:20120504，中國藥品生物制品檢定所)，纖維素酶(活性單位≥15 U·mg-1，上海奧博生物制品有限公司)，所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取工藝 稱取干燥至恒重的2.0 g 余甘子粉末，加6 倍水混勻，加入0.1%纖維素酶，以10倍0.1 mol·L-1檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液在40 ℃活化30 min。將酶液加入提取試管中，超聲提取75 min，用三氯乙酸法［12］除蛋白，離心得濾液，加無水乙醇調(diào)節(jié)至最終濃度75%，置于冰箱，靜置過夜，離心，用丙酮洗滌，得精制多糖。

1.2.2 多糖的檢識 多糖含量測定采用苯酚—濃硫酸法［13］。以葡萄糖含量(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標作圖，得標準曲線方程為:A=2.3346C+0.03539(R2=0.9951)。

1.2.3 單因素試驗 準確稱取2 g 余甘子粉末，酶解，固定其他因素，分別考察超聲時間(15、30、45、60、75、90、105 min)、液料比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1)、超聲溫度(30、35、40、45、50 ℃)和超聲功率(100、200、300、400、500 W)對多糖得率的影響。每組試驗重復3 次，取其平均值。

1.2.4 超聲提取工藝條件的優(yōu)化 采用Box-Behnken 設計原理［14］，綜合單因素試驗結果，對超聲溫度(X1)、超聲時間(X2)和液料比(X3)進行3 因素3水平試驗，并對17 個試驗點加以響應分析。試驗因素與水平設計見表1。每組試驗重復3 次，取其平均值。

表1 試驗因素與水平設計表Table 1 Factors and levels of RAS

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間 如圖1 所示，隨著超聲時間的延長提取率呈上升趨勢，至75 min 時提取率最高，之后提取率呈下降趨勢。由于超聲時間過長會產(chǎn)生熱量使溫度升高，導致酶解作用降低，提取率下降。

2.1.2 液料比 如圖2 所示，多糖提取率隨液料比的增大而提高。當液料比達到6∶1 時，提取率最高，之后隨著液料比的提高，多糖提取率趨于穩(wěn)定趨勢。隨著水量的增加，則多糖溶解得越多，相應多糖提取率就高。但到一定程度后，水量增加對多糖提取率影響較小，且增加生產(chǎn)成本，因此液料比選擇6∶1。

2.1.3 超聲溫度 如圖3 所示，當超聲溫度在30 -40 ℃時，余甘子多糖的提取率不斷提高，40 ℃后隨著超聲溫度的增高而下降。溫度升高有助于超聲波的空化作用，促進多糖物質往外擴散，但溫度超過40 ℃，纖維素酶活力降低，使酶解作用減弱，從而使提取率降低。因此超聲溫度以40 ℃較為適宜。

2.1.4 超聲功率 如圖4 所示，當超聲功率從100 W 提高到300 W 時，余甘子多糖提取率快速增加，到了300 W 后，提取率緩慢增加。因此，從節(jié)約能源角度考慮，超聲功率選擇300 W 較為適宜。

2.2 響應面分析優(yōu)化余甘多糖最佳提取工藝

在單因素試驗基礎上，本研究Box-Behnken 試驗設計與試驗結果見表2。

圖1 超聲時間對余甘子多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on extraction yield

圖2 液料比對余甘子多糖提取率的影響Fig.2 Effect of the ratio of water to material on extraction yield

圖3 超聲溫度對余甘子多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield

圖4 超聲功率對余甘子多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction yield

序號 X1 X2 X3 Y 序號 X1 X2 X3 Y 1 -1.00000 -1.00000 -1.00000 4.00 10 0.00000 0.00000 0.00000 5.74 2 -1.00000 1.00000 1.00000 4.50 11 -1.67332 0.00000 0.00000 3.25 3 1.00000 -1.00000 1.00000 4.25 12 1.67332 0.00000 0.00000 3.50 4 1.00000 1.00000 -1.00000 4.40 13 0.00000 -1.67332 0.00000 3.20 5 0.00000 0.00000 0.00000 5.71 14 0.00000 1.67332 0.00000 3.15 6 -1.00000 -1.00000 1.00000 4.50 15 0.00000 0.00000 -1.67332 3.10 7 -1.00000 1.00000 -1.00000 4.35 16 0.00000 0.00000 1.67332 3.10 8 1.00000 -1.00000 -1.00000 5.50 17 0.00000 0.00000 0.00000 5.76 9 1.00000 1.00000 1.00000 4.10

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗 采用SAS RSREG 程序對表2 進行回歸擬合，得回歸方程:

表3 回歸分析結果1)Table 3 Results of regression analysis of RSA

2.2.2 因素交互效應分析 響應面分析可以運用圖形技術將函數(shù)關系顯示出來，通過直覺觀察選擇試驗設計中的最優(yōu)化條件。因此，采用Statistics 8.0 軟件進行響應面分析(圖4 -6)。由等高線圖可以看出，存在極值的條件在圓心位置。比較圖4 -6 可知，超聲時間、超聲溫度及液料比對多糖提取率的影響都很顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，等高線(響應值)隨其數(shù)值變化而迅速變化。

圖4 超聲溫度與超聲時間對余甘子多糖提取率的響應面圖與等值線圖Fig.4 Responsive surfaces and contours of temperature and time on extraction yield

圖5 超聲溫度與液料比對余甘子多糖提取率的響應面圖與等值線圖Fig.5 Responsive surfaces and contours of temperature and water to material on extraction yield

2.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗證結果 對所建立的模型進行參數(shù)優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為:X1=40.66612 ℃，X2=74.55552 min，X3=5.91031∶1，多糖提取率可達5.65%。修正為超聲溫度41 ℃、液料比6∶1、超聲時間75 min，在此修正條件下進行多糖超聲提取試驗(n=3)，測得提取率為5.76%，與預測值基本吻合。由此可見，本回歸方程較好地預測了理論提取率，且提取參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

圖6 超聲時間與液料比對余甘子多糖提取率的的響應面圖與等值線圖Fig.6 Responsive surfaces and contours of time and water to material on extraction yield

3 小結

本研究通過酶法輔助超聲提取余甘子多糖的單因素試驗表明，在超聲時間75 min、超聲溫度40 ℃、液料比6∶1、超聲功率300 W 時，多糖提取率較高。在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法建立多糖提取率與超聲溫度、超聲時間和液料比之間的二次回歸模型，通過回歸方程優(yōu)化獲得最佳提取工藝參數(shù)為:超聲溫度40 ℃，超聲時間75 min，液料比6∶1。在該工藝條件下余甘子多糖提取率可達5.76%，基本符合預測值(5.65%)。綜合來看，本模型具有較好的預測性能，對生產(chǎn)實踐具有一定借鑒意義。

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