RNA干擾抑制ST細(xì)胞Ⅰ型干擾素受體-2表達(dá)的研究

沈海燕，張春紅，劉志成，孫俊穎，盧　宇，張建峰*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，廣東廣州 510640；2.國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

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RNA干擾抑制ST細(xì)胞Ⅰ型干擾素受體-2表達(dá)的研究

沈海燕1△，張春紅1△，劉志成1，孫俊穎1，盧宇2，張建峰1*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，廣東廣州 510640；2.國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立豬睪丸(ST)細(xì)胞Ⅰ型干擾素受體-2(IFNAR-2)基因knock down模型。采用FuGENE HD轉(zhuǎn)染劑將pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3干擾載體分別轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，經(jīng)熒光定量PCR和Western blot分別檢測(cè)IFNAR2 mRNA和蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，轉(zhuǎn)染干擾載體組均可明顯降低IFNAR2 mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。RNA干擾技術(shù)能夠有效抑制IFNAR2基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究IFNAR2基因的生物學(xué)功能提供可靠的手段，為研究IFNAR2在病毒感染中的作用奠定基礎(chǔ)。

RNA干擾；ST細(xì)胞；Ⅰ型干擾素受體-2

干擾素(inteferon，IFN)發(fā)揮其抗病毒的生物效應(yīng)需要與相應(yīng)的信號(hào)受體結(jié)合，引發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)放大過(guò)程，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控一系列基因表達(dá)相應(yīng)抗病毒蛋白，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用[1-2]。干擾素受體是干擾素連鎖反應(yīng)的初始蛋白[3-4]。根據(jù)IFN的分類(lèi)，IFN受體分為結(jié)合Ⅰ型IFN的Ⅰ型IFN受體和結(jié)合Ⅱ型IFN的Ⅱ型IFN受體。人Ⅰ型IFN受體(type Ⅰ interferon receptor，IFNAR)分布在細(xì)胞表面，由2個(gè)亞單位組成，分別為α(IFNAR-1)和β(IFNAR-2)[5]。IFN-α/β通過(guò)吸附細(xì)胞表面受體IFNAR-1和IFNAR-2發(fā)揮作用，蛋白酪氨酸激酶中的Tyk2和Jak1分別與IFNAR-1和IFNAR-2相關(guān)[6]。目前對(duì)IFNAR的分子結(jié)構(gòu)基本弄清，但I(xiàn)FNAR的研究則處于起步階段，IFNAR很多問(wèn)題仍亟待解決，例如IFNAR在信號(hào)通路中發(fā)揮的作用、如何發(fā)生磷酸化、與IFN結(jié)合的位點(diǎn)等等，這些問(wèn)題的解決有利于IFNAR的相關(guān)研究。

RNAi(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的、在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)的一種基因阻斷技術(shù)[7]。RNAi誘導(dǎo)的特異性基因沉默現(xiàn)象，具有抗病毒入侵[8-10]、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)[11]、調(diào)控基因表達(dá)[12]等作用。本研究將篩選得到的靶向IFNAR2基因的siRNA寡核苷酸片段插入到pSilencer4.1載體系統(tǒng)中，構(gòu)建靶向IFNAR2基因的RNA干擾載體。將干擾載體轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞均能高效抑制IFNAR2基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究IFNAR2基因的生物學(xué)功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同時(shí)為研究IFNAR2受體在病毒感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

pSilencerTM 4.1-neo載體，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；豬睪丸(swine testis，ST)細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢)；DMEM培養(yǎng)基，Gibgo公司產(chǎn)品；FuGENE○RHD Transfection Reagent,Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；Rabbit Anti-Human IFNAR2 Polyclonal Antibody，Gene Tex公司產(chǎn)品；豬β-actin抗體，碧云天生物有限公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜，Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1pSilencer4.1-neo-siRNA-IFNAR2重組載體的構(gòu)建根據(jù)siRNA模板設(shè)計(jì)原則和GenBank中IFNAR2基因的核苷酸序列(№HQ665551)，應(yīng)用Ambion公司siRNATargetFinder軟件設(shè)計(jì)。正義鏈、反義鏈中間由9個(gè)核苷酸TTCAAGAGA連接，反義鏈末端加6個(gè)T作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。模板鏈兩端加入BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將pSilencer4.1-neo載體進(jìn)行BamHⅠ 和Hind Ⅲ雙酶切，使其線(xiàn)性化，電泳鑒定并切膠回收。

雙鏈的合成：編碼鏈和模板鏈各取2 μL，TE緩沖液2 μL，無(wú)菌雙蒸水14 μL，混勻后在90℃水浴加熱3 min，再在37℃水浴孵育1 h，反應(yīng)結(jié)束后直接用于連接反應(yīng)。

連接反應(yīng)體系為：反應(yīng)液2 μL，預(yù)先已用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ 和Hind Ⅲ雙酶切的pSilencer4.1-CMV neo載體6 μL，10×連接酶緩沖液1 μL，T4連接酶1 μL，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素抗性的平板，挑取陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒(分別命名為pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3)，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞在含100 mL/L新生小牛血清、100 000 單位/L青霉素、100 000 μg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染前1 d將ST細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%融合的單層細(xì)胞時(shí)，棄去培養(yǎng)液，為了防止血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率的干擾，用PBS沖洗細(xì)胞3次，以去除培養(yǎng)體系中的血清，按FuGENE HD轉(zhuǎn)染劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，所用試劑均不含抗生素和血清。具體操作如下：將pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3各0.6 μg分別用50 μL DMEM稀釋。同時(shí)將1.8 μL轉(zhuǎn)染試劑用50 μL DMEM稀釋?zhuān)谑覝仂o置5 min，然后將二者混合，于室溫孵育20 min。再將混合液加入24孔板中，37℃孵育4 h后吸掉上清，然后在每個(gè)孔中加500 μL含有20 mL/L血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常培養(yǎng)ST細(xì)胞組。

1.2.3SYBR Green Ⅰ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)將篩選獲得的RNA干擾IFNAR2基因陽(yáng)性的ST細(xì)胞和正常ST細(xì)胞，分別使用胰酶消化收集，取200 μL細(xì)胞液使用RNA抽提試劑盒按照所述方法進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA的濃度。參照One Step SYBG PrimeScript○RRT-PCR Kit Ⅱ產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)液(20 μL體系)：2×One Step SYBG RT-PCR buffer 4 10 μL，IFNAR2-上0.4 μL，IFNAR2-下0.4 μL，酶0.4 μL，RNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。

將上述反應(yīng)液混勻，稍離心后分裝到羅氏96孔板中，每孔20 μL，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：42℃ 5 min，95℃5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);95℃ 1 s，65℃ 15 s，95℃ 1 s，1個(gè)循環(huán)；最后40℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，用LightCycle480軟件分析結(jié)果。

1.2.4Western blot檢測(cè)以上3組RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，用細(xì)胞裂解液提取上述各組細(xì)胞的總蛋白，加熱變性后，100 g/L SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含50 g/L脫脂奶粉的Tris鹽溶液封閉2 h，加入IFNAR2抗體(稀釋比例1∶500)，4℃孵育過(guò)夜。用含Tween-20的Tris鹽溶液洗膜(3次，每次10 min)后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶2 000)，室溫下孵育1 h。化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)條帶。以β-actin為內(nèi)參照，操作過(guò)程同上，β-actin抗體稀釋比例1∶1 000，二抗稀釋比例為1∶2 000。將一抗和二抗孵育完成的膜，經(jīng)ECL顯色液作用后進(jìn)行顯色，然后再進(jìn)行曝光、顯影。

1.2.6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選待轉(zhuǎn)染pSiCMVE1質(zhì)粒的ST細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)液中添加G418至終濃度600 μg/mL，每3 d換一次含有600 μg/mL G418的細(xì)胞培養(yǎng)液。此時(shí)，未轉(zhuǎn)染重組干擾質(zhì)粒的細(xì)胞在G418的作用下逐漸凋亡，換液，去除陰性細(xì)胞。當(dāng)陰性細(xì)胞去除后，將篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞以一定的稀釋度傳到96孔中，并繼續(xù)用含有G418(300 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)，適時(shí)換液，此細(xì)胞記為第1代，并繼續(xù)傳代保存。

2　結(jié)果

2.1RNA干擾載體的測(cè)序結(jié)果

根據(jù)IFNAR2基因mRNA序列(№HQ665551)，按照siRNA模板設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Ambion公司siRNATargetFinder軟件篩選出針對(duì)IFNAR2基因的特異性RNAi靶位，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照,shRNAs靶序列見(jiàn)表1。

將合成的雙鏈與經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ線(xiàn)性化的pSIlencer4.1-neo載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，挑重組陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建的RNA干擾載體正確。

表1　IFNAR2基因shRNAs靶序列

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Roche公司的LightCycler 480型定量PCR儀)，比較分析分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒后，ST細(xì)胞中IFNAR2基因mRNA表達(dá)量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，在分別轉(zhuǎn)染pSiCMVE1、pSiCMVE2或pSiCMVE3干擾質(zhì)粒到ST細(xì)胞后,相對(duì)于轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照質(zhì)粒pSiCMVNC而言，IFNAR2基因的mRNA表達(dá)量均受到了明顯的抑制，抑制率在60%～70%，說(shuō)明這3種干擾質(zhì)粒載體均能夠有效抑制ST細(xì)胞中IFNAR2基因的mRNA表達(dá)。

2.3Western blot檢測(cè)

用Western blot檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒后，ST細(xì)胞中IFNAR2基因的蛋白產(chǎn)物的表達(dá)量變化(圖2)，在分別轉(zhuǎn)染pSiCMVE1、pSiCMVE2或pSiCMVE3干擾質(zhì)粒到ST細(xì)胞后，相對(duì)于轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照質(zhì)粒pSiCMVNC而言，IFNAR2基因的蛋白表達(dá)量均受到了明顯的抑制，干擾載體pSiCMVE1的抑制效率最明顯；而作為內(nèi)參的β-actin的表達(dá)量并不隨著是否轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體而發(fā)生變化(圖2)。

圖1　沉默IFNAR2后mRNA水平的表達(dá)Fig.1　The effect of IFNAR2 siRNA on expression of IFNAR2 mRNA

圖2　Western blot檢測(cè)RNA干擾后IFNAR2蛋白的表達(dá)Fig.2　The effect of IFNAR2 siRNA on expression of IFNAR2 protein detected by Western blot

2.4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選

pSiCMVE1質(zhì)粒經(jīng)FuGENE HD轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后，加入600 μg/mL G418進(jìn)行抗性篩選，每3 d換1次培養(yǎng)液，7 d左右陰性對(duì)照組細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)死亡。13 d左右，陰性對(duì)照組細(xì)胞基本全部死亡，僅有少量細(xì)胞存活。將存活的陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，分別接種于24孔、12孔和6孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)添加300 μg/mL G418進(jìn)行抗性篩選，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，轉(zhuǎn)至25 cm的培養(yǎng)瓶進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，所獲得的改造細(xì)胞系命名為ST-IFNAR2，凍存?zhèn)溆?圖3)。

A.光鏡下轉(zhuǎn)染后G418篩選的ST細(xì)胞;B.光鏡下ST-IFNAR2細(xì)胞

A.ST cells transfected and G418 selected under light microscope;B.ST-IFNAR2 cells under light microscope

圖3轉(zhuǎn)染細(xì)胞和篩選的細(xì)胞系

Fig.3pSiCMVE1 transfected ST cells and IFNAR2 gene knock-down ST-IFNAR2 cells

3　討論

IFN的抗病毒作用是通過(guò)與IFN受體結(jié)合，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)2,5-腺苷酸合成酶和蛋白激酶被活化，最終抑制病毒蛋白的翻譯和病毒RNA的合成[13]。IFNAR是由IFNAR-1和IFNAR-2兩個(gè)亞單位組成的單鏈雜合子，IFNAR-2結(jié)合能力明顯高于IFNAR-1，是研究Ⅰ型IFN受體基因變異以及結(jié)構(gòu)變化的重要靶點(diǎn)[14]。目前關(guān)于Ⅰ型IFN受體的功能，例如與配體的相互作用，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以及生物學(xué)反應(yīng)均已闡明。有研究表明，IFNAR在血細(xì)胞生成過(guò)程、感染過(guò)程中內(nèi)源性和獲得性免疫反應(yīng)中介導(dǎo)Ⅰ型IFN反應(yīng)的作用[15]。

IFNAR的研究日漸深入，使得IFN在臨床上的應(yīng)用從最初的抗病毒、抗腫瘤，發(fā)展到對(duì)自身免疫性疾病、抗移植排斥方面的應(yīng)用。有研究者使用單克隆抗體結(jié)合IFNAR，阻斷了JAK-STAT信號(hào)通路，同時(shí)加入環(huán)孢素A能明顯地延緩?fù)N異體移植的存活時(shí)間[16]。另有研究者發(fā)現(xiàn)，IFNAR缺陷的NZB小鼠可以減輕狼瘡樣疾病[17],其機(jī)制尚不明確，可能是通過(guò)阻斷IFN與IFNAR的結(jié)合，抑制了IFN的免疫功能。因此，對(duì)IFNAR深入的研究，有利于IFN臨床應(yīng)用更具有針對(duì)性，還可以預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)IFN的臨床療效。

RNAi所誘導(dǎo)的特異性基因沉默現(xiàn)象，普遍存在于真核生物中[7]。RNAi不僅是研究基因表達(dá)、調(diào)控和功能的有效手段，更為基因功能測(cè)定和基因治療等開(kāi)辟了新思路[18-19]。目前獲得小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)的方法主要有化學(xué)合成[11]、體外轉(zhuǎn)錄、RNase Ⅲ降解dsRNA、siRNA表達(dá)載體[12]和PCR表達(dá)框方法，其中，siRNA表達(dá)載體是可以進(jìn)行長(zhǎng)期研究的方法，利用該方法將合成的雙鏈克隆到帶抗生素標(biāo)記的載體中，添加相應(yīng)的抗生素在細(xì)胞中進(jìn)行抗性篩選，從而獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，達(dá)到持續(xù)抑制靶基因表達(dá)的目的。本研究在成功構(gòu)建了IFNAR2干擾載體的基礎(chǔ)上，并選出有效干擾質(zhì)粒，然后添加G418篩選穩(wěn)定沉默IFNAR2基因的ST細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究IFNAR2在病毒感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Schoggins J W.Interferon-stimulated genes:roles in viral pathogenesis[J].Curr Opin Virol，2014，6：40-46.

[2]劉穎，侯利華，陳薇.干擾素的信號(hào)傳導(dǎo)和抗病毒效應(yīng)機(jī)制[J].生物技術(shù)通訊，2011，23(1)：123-126.

[3]Muller U，Steinhoff U，Reis L F，et al.Functional roles of type Ⅰ and type Ⅱ interferons in antiviral defense[J].Science,1994,264(5167):1918-1921.

[4]張玲玲，孟祥偉，遲寶榮.干擾素的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2004，7(22)：1715-1716.

[5]Man S M,Kanneganti T D.Type Ⅰ interferon keeps IL-1β in check[J].Cell Host Microbe,2016，19(3):272-274.

[6]Oritani K,Kincade P W,Zhang C,et al.Type Ⅰ interferons and limitin:a comparison of structures,receptors,and functions[J].Cytokine Growth Factor Rev，2001，12(4):337-348.

[7]Elbashir S M,Harborth J,Lendecke l W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411(6836),494-498.

[8]Shen H,Zhang C,Guo P,et al.Effective inhibition of porcine epidemic diarrhea virus by RNA interferenceinvitro[J].Virus Genes,2015，51(2)：252-259.

[9]Liu Y Y,Chen L J,Zhong Y,et al.Specific interference shRNA-expressing plasmids inhibit Hantaan virus infectioninvitroandinvivo[J].Acta Pharmacol Sin,2016,37(4):497-504.

[10]楊亮宇，孫永科，楊玉艾，等.RNA干擾及其在動(dòng)物傳染病方面的研究概況[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，33(6):130-134.

[11]劉倩，史琳凱，李磊，等.RNA干擾抑制大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383TGR5受體表達(dá)的研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(6)：6-10.

[12]宋紅芹，姜翠翠，張?chǎng)斡?，?非洲豬瘟病毒NP419基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(1)：9-14.

[13]劉運(yùn)龍，程遠(yuǎn)國(guó)，劉學(xué)龍.干擾素研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(2)：85-89.

[14]Domanski P,Colamonici O R.The type- interferon receptor.The long and short of it[J].Cytokine Growth Factor Rev，1996，7(2)：143-151.

[15]de Weerd N A,Samarajiwa S A,Hertzog P J.Type Ⅰ interferon receptors: biochemistry and biological funetions[J].J Biol Chem,2007，282(28)：20053-200537.

[16]Benizri E,Gugenheim J,Lasfar A,et al.Prolonged allograft survival in cynomolgus monkeys treated with a monoclonal antibody to the human type Ⅰ interferon receptor and low doses of cyclosporine[J].J Interferon Cytokine Res，1998，18(4)：273-284.

[17]Santiago-Raber M L,Baccala R,Haraldsson K M,et al.Type-Ⅰ interferon receptor deficiency reduces lupus-like disease in NZB mice[J].J Exp Med，2003，197(6)：777-788.

[18]Maduri S.Applicability ofRNA interference in cancer therapy: Current status[J].Indian J Cancer，2015，52(1)：11-21.

[19]呂素芳，郭廣君，王金良,等.應(yīng)用RNAi技術(shù)防控豬病毒病研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(10)：70-74.

Study on Expression Inhibition of Type Ⅰ Interferon Receptor Gene-2 in ST Cells with RNA Interference

SHEN Hai-yan1，ZHANG Chun-hong1，LIU Zhi-cheng1，SUN Jun-ying1，LU Yu2，ZHANG Jian-feng1

(1.Institude of Animal Health,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Open Laboratoryof Veterinary Public Health,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofLivestockDiseasePrevention,Guangzhou,Guangdong,510640,China;2.NationalResearchCenterofVeterinaryBiologicalsEngineeringandTechnology,Nanjing,Jiangsu,210014,China)

To establish a type Ⅰ interferon receptor gene-2(IFNAR2) knock down model of ST cells with RNA interference technique,three interfering vectors of pSilencer-4.1,named pSiCMVE1,pSiCMVE2 and pSiCMVE3 were constructed and transfected into ST cells by FuGENE HD.The expression changes of IFNAR2 mRNA and IFNAR2 protein in ST cells were evaluated with qPCR and Western blot respectively.The results showed that compared with normal control,the expressions of IFNAR2 mRNA and protein were significantly reduced by siRNA transfection in ST cells(P<0.05).RNA interference technique can effectively down regulate the expression of IFNAR2 gene in ST cells specifically.This study provided a novel and reliable method for further study on the biological functions and the role of IFNAR2 in virus infection.

RNA interference；ST cell；type Ⅰ interferon receptor gene-2

2016-02-18

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(31302101)；國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)(2014DFA31730)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B070701015，2016B020212007,2016A040403085，2014B070706011，2014A010107022，2015A020209081，2013B010102012)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303046)

沈海燕(1983-)，女，河南焦作人，博士，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)與免疫學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。*通訊作者

S852.42;Q789

A

1007-5038(2016)09-0048-05