典型油氣藏上方甲烷氧化菌群的分子生物學解析

湯玉平，高俊陽，趙克斌，任 春，許科偉

(中國石化 石油勘探開發(fā)研究院 無錫石油地質(zhì)研究所，江蘇 無錫 214151)

典型油氣藏上方甲烷氧化菌群的分子生物學解析

湯玉平，高俊陽，趙克斌，任 春，許科偉

(中國石化 石油勘探開發(fā)研究院 無錫石油地質(zhì)研究所，江蘇 無錫 214151)

以勝利油田典型油氣藏為研究對象，原位提取土壤中的甲烷氧化微生物群落組成信息，明確了油氣指示微生物類群。通過對油田、氣田和背景區(qū)土壤的pmoA基因克隆文庫分析發(fā)現(xiàn)，來自油氣藏上方土壤與背景區(qū)土壤的甲烷氧化菌群結(jié)構(gòu)的差異較大。背景區(qū)土壤的甲烷氧化Ⅱ型菌——甲基孢囊菌和甲基彎曲菌的相對豐度明顯高于油氣藏上方土壤，而甲烷氧化Ⅰ型菌——甲基球菌和甲基暖菌則顯著減少，表明長期的油氣微滲漏能使甲烷氧化微生物群落向Ⅰ型菌演替。T-RFLP多變量統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，經(jīng)過地質(zhì)歷史時期的微量輕烴連續(xù)馴化，油氣藏上方的甲烷氧化微生物群落發(fā)生了演替，甲基球菌和甲基桿菌可能是推動這種演替變化的關(guān)鍵種群。甲烷氧化pmoA基因的豐度在油氣藏上方的異常可以用于預測下伏油氣藏的存在。

克隆文庫；T-RFLP；pmoA基因；甲烷氧化菌；油氣藏

傳統(tǒng)的微生物勘探技術(shù)具有一定的局限性，特別是樣品采集后的后續(xù)實驗室分析。傳統(tǒng)方法主要采用特異培養(yǎng)基(如富含烴類組分的培養(yǎng)基分離油氣指示微生物)，從環(huán)境樣品中選擇性地對油氣微生物進行計數(shù)和分類，推測其新陳代謝機理，進而推測油氣資源分布的有利區(qū)塊[1-3]。然而，原核微生物通常對環(huán)境具有極強的適應(yīng)能力，即便在烴類濃度極低的情況下，烴類氧化微生物也有可能存在。事實上，20世紀30年代即有科學家提出地球上微生物的分布規(guī)律遵循以下原則：“一切物種無處不在，但卻依賴環(huán)境選擇”[4]。因此非油氣藏環(huán)境樣品中也可能含有極少量的烴類氧化微生物。此外，目前常用的油氣指示微生物培養(yǎng)檢測方法多會注入較高濃度的烴類，在富集土壤樣品中的指示微生物的同時，也可能會刺激其他微生物的生長，這與油氣藏上方原位實際狀況相去甚遠。因此，原位采集環(huán)境樣品，規(guī)避實驗室內(nèi)高濃度烴類物質(zhì)培養(yǎng)過程，從微生物群落的角度直接分析特征微生物組成和數(shù)量的變化規(guī)律，能夠在最大程度上反映油氣藏形成過程中的微生物群落演替規(guī)律，提升微生物勘探技術(shù)的精度。

此外，已知的C1-C4烴類氧化微生物極可能僅占油氣資源指示微生物很少的一部分，大部分的油氣資源指示微生物目前尚不為人所知。采用微生物16S rRNA序列為基礎(chǔ)的分析表明，地球上可培養(yǎng)的微生物僅占所有微生物的1%～10%，絕大多數(shù)微生物無法在實驗室獲得純菌株開展下游研究[5-8]。傳統(tǒng)的研究手段可能忽視了絕大多數(shù)油氣資源指示微生物，無法為油氣勘探提供有力而準確的支撐并準確鑒別油氣資源指示微生物。此外，油氣資源微生物，特別是難培養(yǎng)微生物的形成極可能伴隨有漫長的油氣藏地質(zhì)歷史形成過程，因而，自然條件下的油氣藏指示微生物極可能長期處于貧營養(yǎng)狀態(tài)，屬于難培養(yǎng)微生物，實驗室內(nèi)采用平板法和最大概率法很難準確甄別難培養(yǎng)油氣資源指示微生物的變化規(guī)律，為油氣藏微生物勘探技術(shù)提供有力支撐[9]。此外，平板法和最大概率法的操作過程極為繁瑣、費時，尤其不適于大樣本量的規(guī)模化工業(yè)勘探應(yīng)用[10]。

甲烷氧化菌是一種常用的油氣指示菌，專性利用甲烷作為唯一的碳源和能源[7,9-10]。在甲烷氧化菌的諸多功能基因中，pmoA基因存在于幾乎所有已知的甲烷氧化微生物細胞中，因此被普遍應(yīng)用于土壤或沉積物樣品中甲烷氧化菌的定性和定量研究[9,11-12]。本文針對pmoA基因，采用限制性片段多樣性分析(T-RFLP，Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)、克隆文庫、實時熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應(yīng))等分子生物學技術(shù)，對已知油氣藏上方的指示微生物群落進行精確識別和解析。

1 樣品與實驗

1.1 研究區(qū)石油地質(zhì)概況

陳22塊位于濟陽坳陷陳家莊凸起西段，邵家洼陷延伸的低凸起上，北部以東西向北掉虎4斷層為界，由北向南殘留陳12、嶺1和陳22共3個基巖高點，埋深為1 100～1 270 m。古近系沿西、北、東3個方向向西段基巖高點逐層超，至東營組三段沉積末期披覆其上，新近系館陶組與下伏東營組不整合接觸。陳22塊東營組儲層為東三段灰綠色、灰色含礫砂巖和細砂巖夾少量紫紅色泥巖，單砂層較薄，厚度為1.5～8.0 m，累積厚度為3.0～20.0 m，屬于小型扇三角洲沉積[13]。

1.2 采樣部署

圖1為本研究采樣部署，設(shè)計一條過油田、氣田剖面，采樣深度為60 cm，分別進行群落指紋分析和基因定量。

1.3 土壤DNA提取

采用MP公司的土壤DNA提取試劑盒(FastDNASPIN Kit for Soil)進行提取。

圖1 濟陽坳陷陳22塊微生物樣品采集示意

1.4 甲烷氧化菌pmoA基因擴增

PCR反應(yīng)采用甲烷氧化菌特異性引物。PCR反應(yīng)體系參照文獻[6]，其擴增產(chǎn)物采用專用的PCR純化試劑盒(TaKaRa) 進行純化。

1.5 Real-time PCR基因定量

實時熒光定量PCR是通過實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中擴增產(chǎn)物熒光信號的變化，來實現(xiàn)對樣品中的特定基因進行定量及定性分析[14-16]。pmoA基因重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，將pmoA重組質(zhì)粒進行十倍稀釋以獲得定量標準曲線，采用試劑盒(SYBRPremixExTaqPerfect Real Time)于擴增儀(CFX96 Real-Time PCR)上對標樣和未知土壤樣品進行pmoA基因定量分析。

1.6 克隆文庫和系統(tǒng)發(fā)育學分析

采用Kemp等[17]的漸進采樣方法來檢驗克隆文庫的有效性和代表性。即在所建文庫中隨機抽取不同大小的虛擬文庫，隨后采用多樣性指數(shù)計算各個虛擬文庫組成預測樣品的種群豐富度。隨著虛擬文庫中克隆數(shù)目的增加，預測曲線平穩(wěn)則說明文庫克隆數(shù)量已經(jīng)可以代表給定樣品中主要的微生物類群。

1.7 末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP)

T-RFLP實驗的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件采用Peng等人的方法[18]。 在T-RFLP圖譜中，單個末端限制性片段T-RF(可代表一個物種)的相對豐度為峰高與所有片段總面積之比?？寺∥膸焖玫目寺∽有蛄薪?jīng)過軟件模擬酶切后，可以對應(yīng)T-RFLP圖譜中各個不同末端限制性片段(T-RF)所代表的特定種屬[19](圖2)。

1.8 多元統(tǒng)計分析

對于本研究樣品中出現(xiàn)的所有8種T-RFs 進行去趨勢對應(yīng)統(tǒng)計分析，將這8種不同的T-RFs 進行分組和排序，以計算其第一排序軸的梯度范圍(Lengths of Gradient)。結(jié)果顯示，第一軸小于3.0，因此選用線性模型PCA(Principal Components Analysis，主成分分析)分析[19]。排序分析采用CANOCO生態(tài)學軟件進行運算和繪圖。

圖2 甲烷氧化pmoA基因末端限制性片段長度多態(tài)性圖譜(T-RFLP)

2 結(jié)果與討論

2.1 甲烷氧化微生物多樣性分析

基于16S rRNA的分子生態(tài)學解析技術(shù)已被廣泛用于研究不同環(huán)境中的微生物群落多樣性，如熱帶雨林、水稻田、草甸和海底沉積物中的微生物群落。與石油相關(guān)微生物群落的研究主要集中于地下油藏和油田水等的微生物群落[20-21]，而對于典型油氣藏上方土壤中的微生物群落特征卻知之甚少。本研究針對油藏、氣藏和背景區(qū)的土壤樣品分別構(gòu)建了甲烷氧化功能基因pmoA克隆文庫，全面掌握油氣藏上方甲烷敏感性微生物種屬，為研究油氣藏上方烴類微滲漏生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落特征并開展微生物油氣勘探提供實驗數(shù)據(jù)。

為測試所建克隆文庫是否具有代表性，本研究采用了Kemp等[17]推薦的漸進采樣法，計算了2個多樣性估計指數(shù)SChao1和SACE。計算結(jié)果顯示這2個估算指數(shù)對樣品中微生物類群數(shù)量的預測已趨于平穩(wěn)。如圖3所示，SChao1和SACE指數(shù)表明pmoA基因克隆文庫的覆蓋度已達到理論值的93%，表明所建的文庫已經(jīng)可以代表實際樣品中的微生物多樣性。

通過與已有研究相比較，這些克隆子在海湖沉積物、海底冷泉、水稻根系、垃圾填埋場、活性污泥等好氧或兼氧環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)(圖4)。對隨機挑取的總共155個pmoA基因克隆子做的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，沾化油區(qū)的甲烷氧化菌多樣性比較高，基本覆蓋了所有已知的中溫菌，這些甲烷氧化菌包括甲基球菌(Methylococcus)、甲基暖菌(Methylocaldum)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基桿菌(Methy-lobacter)、甲基孢囊菌(Methylocystis)、甲基彎曲菌(Methylosinus)和甲基單胞菌(Methylomonas)，除此之外還有大量的未培養(yǎng)微生物(圖5)。對3個文庫進行綜合分析，其中甲基桿菌是豐度最大的菌群(26%)，其次是甲基單胞菌(18%)和甲基孢囊菌(14%)，以甲基微菌為最少12%)。

前已述及，根據(jù)甲烷氧化菌細胞結(jié)構(gòu)、代謝途徑和生理代謝途徑的不同，可分類為屬于γ變形桿菌門的Ⅰ型菌，涵蓋甲基桿菌和甲基球菌等10個屬，它們細胞內(nèi)利用甲醛的代謝途徑為戊糖磷酸核酮糖途徑；以及屬于α變形桿菌門的Ⅱ型菌，包括甲基孢囊菌和甲基彎曲菌等4個屬，它們通過絲氨酸途徑同化甲醛。土壤微生物在競爭過程中，通常有2種生態(tài)策略[22]。一種是在外界營養(yǎng)豐富條件下，微生物迅速生長繁殖(Vmax↑)，同時底物利用閾值也隨之上升(Km↑)；另一種情況是在底物濃度極低時，微生物胞內(nèi)酶系自我調(diào)控，把能量消耗降到最低(Vmax↓)，同時底物利用閾值也隨之降低(Km↓)?，F(xiàn)在普遍認為，地表土壤中存在2類甲烷氧化菌[23]，一類是在高濃度甲烷的環(huán)境下生長的，具有較低的親和力(k策略)；另一類是以微滲漏的甲烷為基質(zhì)，具有較高的親和力(r策略)。與之對應(yīng)，甲烷氧化Ⅱ型菌通常在極端環(huán)境土壤中存在(如沙漠、極地等)，而且以利用大氣中的甲烷氣體為主[24-25]。甲烷氧化Ⅰ型菌則通常在土壤甲烷濃度較高的生境中存在，如森林、沼澤和水稻田土壤中[26-29]。那么在地質(zhì)歷史時期的持續(xù)輕烴供應(yīng)下，油氣藏上方的甲烷氧化微生物群落是否會從Ⅱ型菌向Ⅰ型菌演替呢？

圖3 克隆文庫的SACE和SChao1值當SACE和SChao1進入平臺期時，即可認為文庫容量已足夠。

圖4 沾化油區(qū)甲烷氧化pmoA基因克隆文庫系統(tǒng)發(fā)育樹括號中為模擬酶切所得T-RF片段長度；Bootstrap檢驗值低于50%未在圖中顯示

圖5 甲烷氧化菌克隆分布

針對這一假設(shè)，本研究對油田土壤、氣田土壤和背景區(qū)土壤的pmoA基因克隆文庫進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自油藏和氣藏上方土壤中的甲烷氧化微生物群落結(jié)構(gòu)非常相似，與之對應(yīng)，兩點位土壤頂空氣和游離氣中的甲烷含量均占90%以上。背景區(qū)土壤與油氣藏上方土壤相比，甲烷氧化菌群結(jié)構(gòu)則呈現(xiàn)了較大的差異，甲烷氧化Ⅱ型菌——甲基孢囊菌和甲基彎曲菌的相對豐度明顯高于油氣藏上方土壤，而甲烷氧化Ⅰ型菌——甲基球菌和甲基暖菌則顯著減少。因此，從克隆文庫的角度來看，長期的油氣微滲漏確實能使甲烷氧化微生物群落向Ⅰ型菌演替，盡管甲烷的濃度很低(<200×10-6)。侯讀杰課題組[9]最近也對大港油田油氣藏上方土壤中pmoA基因的多樣性進行了研究，并提出甲烷氧化Ⅱ型菌甲基孢囊菌和甲基彎曲菌是2種可能的氣藏指示菌，這與我們的結(jié)論有較大差異。這表明在不同地理條件下，油氣指示菌的類型很有可能發(fā)生變化，其內(nèi)在機制值得進一步研究。

2.2 甲烷氧化微生物群落解析

與克隆文庫相對應(yīng)，T-RFLP圖譜中有9個主要片段(75,98,196,207,244,350,437,456,510 bp)。通過模擬酶切，與克隆文庫的OUT對應(yīng)關(guān)系如下：75 bp的片段對應(yīng)甲基球菌(Methylococcus)和甲基暖菌(Methylocaldum)，244 bp的T-RF對應(yīng)甲基孢囊菌(Methylocystis)和甲基彎曲菌(Methylosinus)，350 bp和456 bp的T-RF對應(yīng)甲基微菌(Methy-lomicrobium)，437 bp的T-RF對應(yīng)甲基單胞菌(Methylomonas)，510 bp的片段對應(yīng)甲基桿菌(Methylobacter)。其余98,196,207 bp的片段未在文庫中找到對應(yīng)的克隆子，可能是PCR反應(yīng)引入的非特異性片段造成的[30]。為全面地了解甲烷氧化菌群在長期地質(zhì)歷史時期的演替特征，本研究對不同來源樣品的pmoA基因T-RFLP數(shù)據(jù)進行了多元統(tǒng)計分析(圖6)，相關(guān)符號及圖解詳見文獻[31]。具體種群變化討論如下：

由圖6可知，不同油氣屬性土壤樣品的聚類特性表現(xiàn)得較為明顯。經(jīng)過地質(zhì)歷史時期的微量輕烴連續(xù)馴化，油氣藏上方的甲烷氧化微生物群落發(fā)生了演替，75bp所代表的甲基球菌(Methylococcus)和508 bp代表的甲基桿菌(Methylobacter)就是推動這種演替變化的關(guān)鍵種群。在對照簇中，244,350和437 bp代表的甲基孢囊菌、甲基彎曲菌、甲基微菌、以及甲基單胞菌則表現(xiàn)出對微量甲烷的高度敏感性。據(jù)文獻報道，莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)常常被作為研究“methane-fixing symboints”的模式菌株，這些都得益于其獨特的生態(tài)特性[32]。莢膜甲基球菌經(jīng)常出現(xiàn)于垃圾填埋場、瘤胃和油氣藏等高甲烷濃度的生境中[33]。

圖6 甲烷氧化微生物群落排序

2.3 甲烷氧化微生物定量解析

為評估油氣基因是否適合快速診斷和識別油氣藏，本研究采集了圖1中一條通過油氣藏的剖面樣品，采用定量PCR技術(shù)對氣指示基因pmoA豐度基于油氣藏的生物地理學分布進行了初步研究。如圖7a所示，甲烷氧化基因pmoA在油氣田上方顯示出明顯的高值區(qū)，非油氣區(qū)為明顯的低值。經(jīng)移動平均化后，對地下油藏和氣藏均有較好的指示效果，且邊界清晰(圖7b)。傳統(tǒng)微生物勘探理論認為甲烷氧化菌僅能指示天然氣藏，而從我們的結(jié)果可以看出，甲烷氧化基因pmoA既可以指示氣藏，同時可以很好地指示高含甲烷氣的油藏。

3 結(jié)論

本研究采用分子生物學方法進行了微生物油氣勘探的探索性研究，將油氣藏形成視為一種長期的、動態(tài)的地質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)過程，基于油氣藏上方烴類微滲漏原理，以特征性微生物群落的長期馴化規(guī)律為主線，選擇勝利油田典型油氣藏為實驗區(qū)，探索油氣藏上方甲烷氧化過程的微生物驅(qū)動者，取得以下認識：

圖7 過油氣剖面甲烷氧化基因pmoA定量數(shù)據(jù)(a)和移動平均化曲線(b)

(1)油藏和氣藏上方土壤中的甲烷氧化微生物群落結(jié)構(gòu)非常相似，而背景區(qū)土壤的甲烷氧化菌群結(jié)構(gòu)的差異較大。背景區(qū)土壤的甲烷氧化Ⅱ型菌——甲基孢囊菌和甲基彎曲菌的相對豐度明顯高于油氣藏上方土壤，而甲烷氧化Ⅰ型菌——甲基球菌和甲基暖菌則顯著減少，表明長期的油氣微滲漏能使甲烷氧化微生物群落向Ⅰ型菌演替。

(2)T-RFLP多變量統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，經(jīng)過地質(zhì)歷史時期的微量輕烴連續(xù)馴化，油氣藏上方的甲烷氧化微生物群落發(fā)生了演替，甲基球菌(Methy-lococcus)和甲基桿菌(Methylobacter)可能是推動這種演替變化的關(guān)鍵種群。

(3)pmoA基因豐度的分布規(guī)律得知，在油氣藏上方土壤中會出現(xiàn)“微生物熱點”, 這種異?，F(xiàn)象可以用作檢測和預測下伏油氣藏的存在。

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(編輯 韓 彧)

Molecular biological analysis of methanotrophic bacterial community above typical oil and gas reservoirs

Tang Yuping, Gao Junyang, Zhao Kebin, Ren Chun, Xu Kewei

(Wuxi Research Institute of Petroleum Geology, SINOPEC, Wuxi, Jiangsu 214151, China)

In this study, the community structure of aerobic methanotrophic communities were investigated at light hydrocarbon microseeps above a known oil band gas field in the Shengli Oilfield. Clone library analysis of thepmoAgene revealed major differences in the methanotrophic community composition between oil and gas fields and the surrounding soils. The relative abundance of methanotrophic Methylocystis and Methylosinus (type Ⅱ) in surrounding soils is obviously lower in oil and gas field soils than surrounding soils, ut the relative abundance of methanotrophic Methy-lococcus and Methylocaldum (type I) presents a reverse tread. Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis confirmed that one distinct Methylococcus and Methylobacter-related group may dominate the community at hydrocarbon microseeps. ThepmoAgene copy numbers determined by real time PCR also indicated that methane oxidizing microbial community anomalies above typical oil and gas reservoirs exist objectively.

clone library; T-RFLP;pmoAgene; methanotrophic bacteria; oil and gas reservoirs

1001-6112(2014)05-0605-07

10.11781/sysydz201405605

2013-05-14；

2014-07-31。

湯玉平(1961—)，男，博士、教授級高級工程師，從事油氣地球化學勘探研究。E-mail: tangyuping.syky@sinopec.com。

中國石化科技部項目(P11058)資助。

TE135

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