肱二頭肌長頭肌腱過度使用中相關(guān)生長因子蛋白表達規(guī)律的研究

高曉嶙，白云飛，王若晗，張曉蘭

肱二頭肌長頭肌腱過度使用中相關(guān)生長因子蛋白表達規(guī)律的研究

高曉嶙1,2，白云飛3，王若晗2，張曉蘭2

為研究生長因子在過度使用導(dǎo)致肌腱退行性變中的作用機制，利用SD大鼠8周下坡跑模型造成肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝段退行性變，采用免疫組織化學(xué)等方法，檢測運動各階段肌腱IGF1、TGFβ1、 BMP12 、bFGF蛋白表達情況。 結(jié)果：在肱二頭肌長頭整體肌腱中，只有bFGF表達顯著增加；bFGF在過度使用第2周顯著升高(P<0.01)，第4周下降，第6周(P<0.05)和第8周(P<0.01)再次持續(xù)升高。在肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝段，IGF1表達無顯著變化，TGFβ1 、bFGF、 BMP12表達均顯著增高；TGFβ1表達逐漸升高，第6周達到高峰(P<0.05)，第8周迅速下降；bFGF 表達在第4周迅速升高到峰值(P<0.01)，然后下降，到第8周與對照組無顯著差異；BMP12蛋白表達逐漸增加，第6周達到高峰(P<0.05)，第8周略下降。結(jié)論：肌腱過度使用中相關(guān)生長因子蛋白長期異常表達是肌腱退行性變的重要病理變化，有可能推動了肌腱退行性變的進程。

過度使用；肌腱；退行性變；生長因子

生長因子在調(diào)節(jié)肌腱細胞功能，基質(zhì)代謝，肌腱干細胞增殖、分化等方面具有重要的功能，在肌腱損傷修復(fù)、退行性變等病理過程中也具有重要作用。有研究[14,7]顯示，肌腱退行性變組織中部分生長因子基因高表達，且肌腱細胞對生長因子反應(yīng)異常，并據(jù)此推測在過度使用導(dǎo)致反復(fù)損傷積累過程中，肌腱組織有可能受到長期生長因子的異常作用，引起肌腱細胞功能異常，導(dǎo)致肌腱發(fā)生退變。本研究擬通過建立肌腱過度使用動物模型，檢測相關(guān)細胞生長因子蛋白表達變化，綜合探討過度使用中相關(guān)細胞生長因子表達規(guī)律在肌腱退行性變中的作用機制，為揭示肌腱退行性變的病理機制提供相關(guān)實驗依據(jù)和新思路。

1 研究材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠50只(維通利華公司提供)，兩月齡，體重250.4±8.6 g。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18±2℃，光照時間12 h，相對濕度40%～55%。大鼠隨機分為5組：對照組、2周組、4周組、6周組、8周組，每組10只SD大鼠。各組大鼠初始體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。

1.2 運動方案

對照組大鼠籠中自由活動；2周組大鼠進行2周運動訓(xùn)練；4周組大鼠進行4周運動訓(xùn)練；6周組大鼠進行6周運動訓(xùn)練；8周組大鼠進行8周運動訓(xùn)練。采用跑臺(中國杭州段式制作DSPY0202)建立下坡跑肱二頭肌肌腱過度使用模型[2,6,16]。2、4、6、8周組大鼠先開始4天適應(yīng)性訓(xùn)練(10°下坡跑，速度17～20 m/min，15 min/d)，然后開始正式訓(xùn)練(10°下坡跑，速度20～25 m/min，1.5 h/d，每周運動6天，休息1天)。

1.3 取材、切片與HE染色

對照組大鼠與8周組大鼠一起處死，取肌腱。2、4、6、8周組大鼠分別于最后一次運動結(jié)束24 h后處死，左側(cè)取肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)間溝部位，生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，沿縱軸切片，厚度0.3 μm。蘇木素伊紅染色(HE)，光鏡(10×20)觀察肌腱損傷情況。右側(cè)取肱二頭肌長頭肌腱全長，生理鹽水沖洗，液氮固定，-70℃保存，以備ELASA和Westen blot檢測用。1.4 免疫組化染色

采用免疫組化S-P法,第一抗體采用兔多克隆BMP12抗體(Ab92756)、兔多克隆bFGF抗體(Ab106245)、兔多克隆TGFβ1抗體(Ab31013)、兔多克隆IGF1抗體(Ab39398)。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，陽性免疫復(fù)合物為棕色。光鏡觀察，放大倍數(shù)為400倍(10×40)。每個樣本隨機選3張切片，每張切片隨機選擇5個視野進行分析。

1.5 ELASA與Westen Blot

用濾紙吸干肱二頭肌肌腱組織液和血液，稱重肌腱組織，加入5倍PBS溶液，玻璃勻漿器勻漿3 min，置于冰上5 min，重復(fù)5次，至勻漿徹底。3 500 rpm離心10 min，取上清液。沉淀組織再次加5倍PBS溶液，玻璃勻漿器勻漿3 min，置于冰上5 min，重復(fù)5次，至勻漿徹底。3 500 rpm離心10 min，取上清液,合并兩次上清液備用。采用Abcam公司ELASA試劑盒檢測右側(cè)肌腱bFGF、 TGFβ1、IGF1蛋白表達；Westen Blot法檢測右側(cè)肌腱BMP12蛋白表達，一抗為兔多克隆BMP12抗體(Ab92756)。

1.6 圖像分析與統(tǒng)計學(xué)處理

采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對免疫組化切片和Westen Blot電泳條帶的平均光密度(MOD)值進行測定，以MOD值的變化反映蛋白表達量的相對變化。采用SPSS 19.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，采用One-Way ANOVA方差分析總體蛋白表達差異，組間兩兩比較采用Bonferroni.法檢驗，結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)間溝段組織病理

HE染色發(fā)現(xiàn)對照組肌腱結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維排列緊密、相互平行，著色正常；肌腱細胞核呈梭形或紡錘形，均勻排列在膠原纖維之間。從2周組開始出現(xiàn)膠原纖維結(jié)構(gòu)和排列逐漸紊亂；4周組出現(xiàn)膠原纖維著色變淺或不均勻，部分肌腱細胞核向圓形轉(zhuǎn)變，排列逐漸紊亂；6周組出現(xiàn)膠原纖維斷裂，肌腱膠原纖維結(jié)構(gòu)和排列更加紊亂，圓形細胞核比例增多，細胞外基質(zhì)比例逐漸增多；8周組細胞分布更加不均，進一步出現(xiàn)局灶性細胞聚集。各組沒有發(fā)現(xiàn)明顯血管增生和透明樣變性，也未見炎癥細胞(圖1)。

圖 1 各組切片HE染色結(jié)果(200×)

2.2 生長因子蛋白表達

2.2.1 肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝段

采用單因素方差分析檢驗對照組與各運動組的肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝段生長因子蛋白表達的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ1(P<0.05)、FGF(P<0.01)、BMP12(P<0.05)3個因子的蛋白表達有顯著性差異。

IGF1蛋白表達的MOD在各組之間無顯著性差異(P>0.05)；TGFβ1蛋白表達MOD值呈逐漸升高趨勢，到第6周達到高峰，第8周出現(xiàn)顯著下降；bFGF蛋白表達的MOD在第4周明顯升高，之后又逐漸下降，第8周重新降到對照組水平。BMP12蛋白表達MOD逐漸增加，第6周升高明顯，第8周又略有下降(圖2)。

2.2.2 肱二頭肌長頭肌腱整體生長因子蛋白表達

采用單因素方差分析檢驗對照組與過度使用各組肱二頭肌長頭肌腱整體的生長因子蛋白表達的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF蛋白濃度在各組之間有顯著性差異(P<0.01)。

表 1 本研究肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝段生長

表 2 本研究各組肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝部位生長因子蛋白表達(MOD)比較一覽表

圖 2 本研究過度使用中肱二頭肌長頭肌腱結(jié)

各組肌腱整體IGF1 、TGFβ1 和BMP12蛋白表達未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。IGF1平均濃度在207.86～297.93 pg/ml之間；TGFβ1平均濃度在192.35～259.88

pg/ml之間。隨著過度使用進行，第2周肌腱整體bFGF濃度出現(xiàn)顯著升高，第4周下降，然后再次升高；2周組、8周組與對照組之間差異具有高度顯著性(P<0.01)；6周組與對照組之間差異具有顯著性(P<0.05)。bFGF平均濃度變化范圍為91.41～134.23 pg/ml。

表 3 本研究肱二頭肌長頭肌腱整體生長

表 4 本研究各組肱二頭肌長頭肌腱整體生長因子蛋白表達比較一覽表

3 討論

目前，有關(guān)腱病中的病理特征已經(jīng)確定[11]，主要為肌腱退行性變，如膠原纖維排列紊亂，失去正常的緊密平行排列的結(jié)構(gòu)，甚至出現(xiàn)粘液樣變性或透明樣變性；腱細胞梭形外觀消失，核變圓形，細胞外基質(zhì)增多，可見局灶性細胞增多，沒有炎癥細胞；肌腱內(nèi)可伴有不規(guī)則血管增生。本研究采用前人研究[2,6,16]建立的SD大鼠肱二頭肌過度使用模型，切片顯示，肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝段從運動后第2周就出現(xiàn)了部分肌腱退行性變，如膠原纖維排列紊亂等，并且逐漸加重，相繼發(fā)生膠原纖維淡染、細胞核變圓、細胞分布不均、纖維斷裂等，結(jié)果證實肱二頭肌過度使用模型建立成功。

肌腱具有很強的耐壓、抗張力和抗摩擦的能力。力學(xué)刺激會對肌腱細胞表面的牽張受體和黏附位點產(chǎn)生很大作用，導(dǎo)致一系列生物效應(yīng)的瀑布效應(yīng)[4]。有研究[12]顯示，周期性張力刺激可以提高許多生長因子表達，提示適宜的運動可以通過生長因子實現(xiàn)對肌腱的重塑。然而，在過度使用中是否也存在相關(guān)生長因子的高表達，其變化規(guī)律，是否在肌腱退行性變中發(fā)揮了作用還很少有報道。

本研究顯示，過度使用過程中肱二頭肌長頭肌腱易損部位(結(jié)節(jié)溝段)與肌腱撕裂后愈合階段的生長因子表達有明顯區(qū)別。許多研究顯示，肌腱斷裂修復(fù)時多數(shù)生長因子表達升高相對較短，約在1周內(nèi)。例如：Würgler-Hauri等人[18]利用大鼠崗上肌腱斷裂修復(fù)術(shù)模型發(fā)現(xiàn)，bFGF、BMP12、BMP 13、BMP14、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)、TGFβ1在損傷后1周蛋白表達增高，然后迅速下降恢復(fù)到對照組水平。Heisterbach 等人[9]研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠跟腱斷裂后bFGF、 BMP12 和VEGF表達升高1周，然后bFGF、 BMP12迅速下降，而VEGF表達持續(xù)保持較高水平。陳亮等人[1]研究大鼠跟腱損傷部位修復(fù)過程中生長因子基因表達，發(fā)現(xiàn)IGF-1、bFGF、BMP12、TGFβ1等大部分生長因子在肌腱損傷早期(1周內(nèi))高表達，然后迅速下降。這些肌腱斷裂修復(fù)研究結(jié)果表明，生長因子高表達在早期肌腱修復(fù)中起重要作用，但后期并不需要。本研究結(jié)果顯示，過度使用過程中局部易損部位相關(guān)生長因子增高表達時間相對較長，大于2周，高峰期多數(shù)在第4～6周，且變化不一致，相對較亂。

從生理學(xué)來看，肌腱修復(fù)的相關(guān)生長因子作用復(fù)雜，且相互影響，對肌腱的生物學(xué)效應(yīng)與劑量，細胞內(nèi)外環(huán)境有密切關(guān)系，所以，長期高表達也許不一定有利于肌腱修復(fù)。例如，Nielsen研究[15]發(fā)現(xiàn)，長期過高/過低血漿IGF水平都會導(dǎo)致小鼠肌腱膠原纖維直徑顯著下降；Liu等人研究[13]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性IGF1和BMP2能促進PEG2誘導(dǎo)的肌腱干細胞脂肪分化；Bell等人[8]證實通過注射TGFβ1，可以造成跟腱退行性變化；Jiang等[10]研究結(jié)果提示，TGFβ1在腱病中I膠原合成與推動細胞凋亡上可能扮演重要角色；體外培養(yǎng)研究[5]顯示，大劑量(30～50 μg/l)bFGF對肌腱細胞增殖和基因表達均有強烈抑制作用；Tang等人研究[17]還提示，bFGF的變化可能影響TGFβ1、血管內(nèi)皮生長因子、結(jié)締組織生長因子堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(scleraxis)、胰島素樣生長因子的表達。我們推測肌腱斷裂修復(fù)時生長因子的協(xié)同變化可能促進了肌腱愈合過程，而過度使用中長期雜亂生長因子表達有可能不利于肌腱修復(fù)，甚至可能導(dǎo)致細胞功能紊亂、干細胞錯誤分化、基質(zhì)代謝紊亂，推動肌腱退行性變的病理進程。

此外，本研究結(jié)果還顯示，過度使用中肱二頭肌長頭肌腱整體與局部易損部位的生長因子表達規(guī)律不一致。肌腱整體只有bFGF蛋白表達顯著增加，第2周顯著升高，第4周下降，第6周和第8周再次顯著升高；IGF1、TGFβ1、BMP12都沒有顯著性變化。結(jié)節(jié)溝段肌腱TGFβ1表達逐漸增高，到第6周最為顯著，第8周有迅速下降；bFGF表達在第4周迅速升高到峰值，然后，又迅速下降，第8周與對照組無顯著差異；BMP12蛋白表達逐漸增加，在第6周達到高峰，第8周又略有下降。IGF1在整個8周運動過程中都沒有出現(xiàn)顯著性變化。肱二頭肌長頭肌腱結(jié)節(jié)溝部位是臨床腱病好發(fā)部位，長期承受著比周圍肌腱更高的機械負(fù)荷刺激。本研究推測，正常情況下肌腱整體以bFGF 蛋白表達增高應(yīng)對下坡跑運動，提高肌腱修復(fù)能力，而肌腱結(jié)節(jié)溝部位因為承受了長期過度的機械刺激量與強度，導(dǎo)致了更多生長因子長期高表達，肌腱在這種長期紊亂調(diào)節(jié)下，就可能會出現(xiàn)功能紊亂，向肌腱退行性變發(fā)展。肌腱整體與局部易損部位生長因子表達差異的結(jié)果提示：生長因子表達種類和出現(xiàn)順序可能與承受的機械負(fù)荷大小有關(guān)，長期異常生長因子高表達與肌腱退行性變有關(guān)，可能推進了其病理進程。本研究還顯示，IGF1蛋白表達在肌腱整體和易損部位都沒有發(fā)生明顯改變，提示并非所有的生長因子在肌腱過度使用中都會發(fā)生表達變化。其他一些大鼠肌腱研究也證實了這一點，如李敏等[3]在大鼠急性跑臺運動后檢測跟腱中IGF1基因、蛋白表達，也未發(fā)現(xiàn)有明顯變化；Molloy等[14]檢測了大鼠崗上肌腱過度使用肌腱基因表達譜，同樣沒有發(fā)現(xiàn)IGF1基因表達出現(xiàn)上調(diào)/下調(diào)變化。

4 小結(jié)

在肌腱過度使用中，肱二頭肌長頭肌腱整體與局部易損部位的生長因子蛋白表達規(guī)律不一致；局部易損部位相關(guān)生長因子蛋白表達變化較亂，并非所有生長因子都出現(xiàn)變化，與肌腱斷裂修復(fù)有明顯區(qū)別；肌腱過度使用中相關(guān)生長因子蛋白長期異常表達是肌腱退行性變的重要病理變化，有可能推動了肌腱退行性變的進程。

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StudyonGrowthFactorsProteinExpressionCharacteristicsinTendonofLongHeadofBicepsBrachiiduringOveruseProcess

GAO Xiao-lin1,2,BAI Yun-fei3,WANG Ruo-han2,ZHANG Xiao-lan2

Objective:This experlment was dessgned to study the role of growth factors in tendon degeneration overuse-induced.Methods:This study established the rats tendon overused model by downhill running,detected growth factors gene expression in various stages of overuse by immunohistochemistry.Results:In whole tendon,bFGF protein expression was significantly increased during the downhill running,but TGFβ1,bFGF and BMP12 had no significantly change.bFGF was significantly increased at 2 weeks (P<0.01),decreased at 4 weeks,and raised again at 6-8 weeks.In rat biceps brachii tendon intertubercular sulcus parts,IGF1 expression had no significantly change,but expression of TGF β1,bFGF,and BMP12 were significantly increased.The expression of TGF β1 increased gradually,reached a peak at 6 weeks (P<0.05),decreased rapidly at 8weeks.The expression of bFGF reached the peak at 4 weeks value (P<0.01),and then decreased at 8 weeks.The expression of BMP12 protein increased gradually,reached a peak at 6 weeks (P<0.05),and declined slightly at 8 weeks.Conclusion:During overuse process,long-term abnormal expression of growth factors was an important pathological chang of tendon degeneration,which probably pushed the tendon degeneration process.

overuse;tendon;degeneration;growthfactor

1000-677X(2014)09-0044-05

2014-03-20；

：2014-08-06

高曉嶙(1974-)，男，安徽人，副研究員，博士，研究方向為運動損傷預(yù)防與康復(fù)，Tel：(010)87182525，E-mail：gao321452@sina.com。

1.國家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061；2. 北京體育大學(xué)，北京100084；3.國家體育總局運動醫(yī)學(xué)研究所 體育醫(yī)院，北京 100061 1.China Institute of Sport Science,Beijing 100061，China;2.Beijing Sports University,Beijing 100084.China;3.National Research Institute of Sports Medicine,Beijing 100061,China.

G804.7

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