草酸青霉菌果膠酶誘導煙草抗TMV的研究

尤升波　游銀偉

摘要：本試驗就草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）的固態(tài)發(fā)酵提取產(chǎn)物——果膠酶粗酶液誘導煙草對煙草花葉病毒（TMV）的抗性進行了研究。以不同濃度果膠酶粗酶液噴霧處理2個煙草品種，超過100 U/mL的各濃度處理，病斑抑制率均達到50%以上。通過果膠酶誘導煙草抗病的時效性、加強誘導的效果、系統(tǒng)誘導抗病性、處理方法不同對煙草抗TMV效果以及果膠酶液對TMV病毒毒性的研究，結果表明：誘導處理2、4 d后接種TMV病毒，果膠酶的誘導抗病效果最明顯，病斑抑制率在50%左右；二次加強誘導處理可以提高煙草抗TMV的效果；果膠酶可誘導煙草產(chǎn)生對TMV的系統(tǒng)獲得抗性；葉面噴霧果膠酶處理方法，對煙草抗TMV的效果最顯著；果膠酶液中不含有影響TMV致病力的因子。由此表明，果膠酶對TMV的防治是通過激發(fā)煙草植株體內一系列抗病防御反應而增強自身抗病能力的。

關鍵詞：草酸青霉菌；果膠酶；煙草花葉病毒；誘導抗病性

中圖分類號：S432.2：S435.72文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0102-05

煙草花葉病毒?。═MV）是一種系統(tǒng)侵染性病害，在田間發(fā)生后危害嚴重，是世界各國煙草生產(chǎn)上重要的病害之一，每年都造成巨大的經(jīng)濟損失[1，2]。眾所周知，煙草花葉病毒病在防治上相當困難，迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)能夠根除或有效治療植物病毒的措施。此外，一些新的煙草育苗技術，如漂浮育苗方法的大面積推廣應用，也加重了TMV的發(fā)生[3]。

誘導抗病性是指植物在各種誘導因子的作用下，使其體內存在的一系列潛在的與抗病性有關的基因誘導表達，從而使植物產(chǎn)生抗病性，即系統(tǒng)獲得抗性（SAR）[4]。近年來，隨著對誘導抗病性的深入研究，一系列環(huán)境友好型生物誘導劑為人們所開發(fā)、研究，其中主要包括植物源誘導抗病劑[5，6]及微生物源誘導抗病劑[7，8]。一些具有誘導抗病作用的激發(fā)子已經(jīng)開始在田間應用[9]，從而為植物病害防治提供了一種新的途徑。彭霞薇等[10，11]的研究表明，草酸青霉菌固態(tài)發(fā)酵獲得的果膠酶具有誘導黃瓜抗黑星病的作用，而且可以提高黃瓜體內多種防御酶系的含量[12]。但該發(fā)酵產(chǎn)物在誘導煙草植株抗TMV的研究方面，未見文獻報道。果膠酶作為工業(yè)酶制劑，在食品工業(yè)、紡織工業(yè)等行業(yè)中已有廣泛應用[13]。它們在誘導植物抗病性方面的研究，將開拓果膠酶的應用范圍，使其發(fā)揮更廣泛的作用?；诖耍驹囼炑芯苛瞬菟崆嗝咕≒enicillium oxalium）固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶對TMV的抗性作用。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1植物材料及TMV供試煙草包括普通煙（Nicotiana tobacum L.）和心葉煙（Nicotiana glutinosa），普通煙品種為Xanthi-nc。煙草幼苗長到6～8葉期時待用。試驗所用TMV均由中國農業(yè)大學植物病理系病毒室提供。

1.1.2果膠酶液的制備果膠酶發(fā)酵液（簡稱果膠酶）的制備參照彭霞薇等[10]的方法。提取后的果膠酶于4℃冰箱中保存。果膠酶濃度根據(jù)每毫升酶液中含有的果膠酶活力單位確定，果膠酶活力單位（U）依據(jù)AJDA法確定[14]。

1.2試驗方法

1.2.1果膠酶誘導煙草抗病性的初步測定分別配制濃度為10、20、40、60、100、150、200 U/mL的果膠酶溶液，均勻噴霧處理煙草全株葉片的正面和背面，每株煙草葉片果膠酶用量為10 mL，對照噴清水。3 d后，挑戰(zhàn)接種煙草花葉病毒（TMV）。選用上述2個煙草品種，每處理10株苗，接種6 d后調查葉片發(fā)病情況。

1.2.2果膠酶應用時間對誘導抗性的影響（1）接種TMV后24、48 h，分別用果膠酶噴霧處理煙草全株；（2）果膠酶與TMV汁液混合后同時摩擦接種處理煙草；（3）果膠酶誘導處理后1、2、4、6、8、10 d，挑戰(zhàn)接種TMV。果膠酶的使用濃度為100 U/mL。煙草品種為Xanthin-nc。接種6 d后調查葉片發(fā)病情況。

1.2.3果膠酶加強誘導煙草對TMV的抗性作用試驗分2批處理，即誘導處理1次和誘導處理2次。誘導處理1次即以100 U/mL果膠酶液誘導處理煙草全株葉片。誘導處理2次即以100 U/mL果膠酶液誘導處理煙草全株葉片，3 d后再強化誘導處理1次。兩批植株在誘導處理0、1、2、4、8、12 d后分別接種TMV病毒汁液。煙草品種為Xanthi-nc。接種病毒6 d后，調查葉片發(fā)病情況。

1.2.4果膠酶的系統(tǒng)誘導抗性試驗取長勢均一（10葉期）的煙草Xanthi-nc進行試驗，用于誘導處理的果膠酶液濃度為100 U/mL。在第5葉（從最底葉計），以噴霧誘導法進行處理，以噴清水的煙草植株做對照。3 d后，分別在處理葉（第5葉）、處理葉上部的未處理葉片（第6、7、8葉）及處理葉下部未處理葉片（第3、4葉）表面，摩擦接種TMV汁液。接種6 d后調查各葉片發(fā)病情況。

1.2.5不同處理方法對果膠酶誘導抗病效果的影響采用3種不同的處理方法：①葉表面噴霧法。100 U/mL果膠酶液噴霧處理煙草中部葉片（即第4、5片葉），果膠酶液用量為10 mL，3 d后對處理葉和上部未處理的葉片（6～8葉）進行TMV摩擦接種；②注射法。在處理葉片（選取第4和第5片葉）基部主脈兩側各注射一個點，每點各注射20 μL果膠酶溶液，3 d后以同樣方法加強誘導1次，第二次處理3 d后，在處理葉片及上部未處理葉片（6～8葉）上接種TMV；③灌根法。在接種TMV前7天，用100 U/mL果膠酶溶液灌根處理煙草植株，隔一天處理1次，連續(xù)處理3次，每次每株的果膠酶用量為10 mL，最后一次處理3 d后，在第4～8片葉上接種TMV。分別以清水代替果膠酶液作為對照。供試煙草品種為Xanthin-nc。接種6 d后，調查葉片發(fā)病情況。endprint

1.2.6果膠酶液對TMV的毒性試驗將果膠酶配制成40、200、400 U/mL 3個濃度的溶液，分別與等體積TMV懸浮液混合，使果膠酶的最終濃度分別為20、100、200 U/mL。將混合液在4℃條件下放置0、4、8、12、24、48 h后，分別接種煙草植株第4～8葉，所用煙草品種為Xanthi-nc。接種6 d后調查各葉片發(fā)病情況。

1.3病情調查及誘導效果計算

病情調查項目分為枯斑數(shù)、枯斑大小，并計算枯斑抑制率。

枯斑抑制率（%）=（1-處理葉枯斑數(shù)/對照葉枯斑數(shù)）×100

2結果與分析

2.1不同濃度果膠酶誘導煙草對TMV抗性作用

由表1可以看出，果膠酶液對2種煙草均有誘導抗病效果，且隨著果膠酶誘導濃度的提高，對煙草植株的抗病效果也逐漸增高。從心葉煙和Xanthi-nc產(chǎn)生枯斑情況來看，當果膠酶的使用濃度高于100 U/mL（包括100 U/mL）時，對TMV在寄主上產(chǎn)生枯斑的抑制率均超過50%。試驗中還發(fā)現(xiàn)，在200 U/mL的果膠酶使用濃度下，如果誘導期間溫室環(huán)境溫度過高（超過35℃），則會對煙草葉片產(chǎn)生藥害。

2.2果膠酶應用時間對誘導抗性的影響

由圖1可以看出，果膠酶噴霧前先接種TMV或果膠酶液與TMV汁液混合后接種，均不能降低葉片枯斑數(shù)。而誘導噴霧后1～10 d再接種TMV，均能不同程度降低煙草葉片的枯斑數(shù)，且誘導后2、4 d接種TMV的植株，枯斑數(shù)的抑制效果最為明顯，病斑抑制率分別為49.54%和52.75%。由此也可以看出，果膠酶液對TMV沒有治療作用，它對TMV的防治作用是通過誘導煙草自身產(chǎn)生防御反應來提高煙草抗TMV侵染的。

2.3果膠酶加強誘導對煙草抗TMV的影響

由圖2可見，誘導處理2次的煙草，每葉平均枯斑數(shù)在各接種時間內均比誘導處理1次的要低，而且誘導抗病的持效期也長于誘導處理1次的植株，誘導處理后10、12 d接種TMV時，誘導處理1次的植株病斑抑制率低于10%，而誘導處理2次的植株病斑抑制率仍在20%以上，對TMV仍有一定的誘導抗病作用。

2.4果膠酶的系統(tǒng)誘導抗性試驗

由表2可以看出，與對照相比，第5葉經(jīng)果膠酶誘導處理的植株中各葉位的平均枯斑數(shù)均有不同程度降低。通過計算病斑抑制率可以看出，在果膠酶誘導處理葉上的病斑抑制率最高，其次是緊靠處理葉的第6葉、第4葉，離處理葉片越遠的葉片誘導效果相對越低（見圖3）。上述結果表明，果膠酶除了可以誘導煙草產(chǎn)生對TMV局部抗性外，還可誘導煙草產(chǎn)生對TMV的系統(tǒng)獲得抗性。由此可以推斷果膠酶在誘導煙草抗性中，產(chǎn)生一種可向上下移動的信號分子，該信號分子可從處理部位傳導葉。下圖同。

到非處理部位并激活其防御系統(tǒng)，從而誘導該部位產(chǎn)生抗性。

2.5不同處理方法對果膠酶誘導抗病效果的影響

由表3可見，用100 U/mL果膠酶以不同方法進行誘導處理后，Xanthi-nc煙草的誘導抗TMV效果不同。其中以葉面噴霧處理誘導效果最顯著，病斑抑制率達46.24%；其次是葉柄注射誘導方法，病斑抑制率為19.70%；灌根處理對煙草抗TMV效果不理想，病斑抑制率僅為7.86%。試驗中還發(fā)現(xiàn)，灌根處理的植株生長速度比對照略快些，可能是果膠酶液中的營養(yǎng)成分被植株根吸收，從而促進了植株生長。

2.6果膠酶液對TMV的毒性試驗

在試驗使用的果膠酶濃度范圍內，放置不同時間處理對TMV致病力均無影響，處理間每葉平均枯斑數(shù)差異不明顯（表4）。由此表明，果膠酶液中不含有影響TMV致病力的因子，煙草植株表現(xiàn)出的對TMV抗性提高可能是由于在果膠酶作用下，煙草植株體內一系列抗病防御反應被激活，增強了寄主自身的抗病能力。該試驗結果也進一步證明，果膠酶具有誘導煙草抗TMV的作用。

3討論

利用果膠酶作為激發(fā)子誘導植物抗病性研究的文獻較少。Vidal等[15]的試驗證明，煙草空脛病病菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora）產(chǎn)生的果膠酶能夠誘導煙草對該病的抗性。彭霞薇等[10～12，16]的研究結果表明草酸青霉發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶粗酶液可以誘導黃瓜對黑星病的抗性，其中起主要誘導抗病作用的是果膠酶蛋白因子。本試驗利用草酸青霉菌果膠酶發(fā)酵液誘導煙草對TMV的抗性進行了研究，結果表明，在一定的應用條件下，草酸青霉果膠酶能夠誘導煙草抗TMV。

在測定果膠酶濃度對誘導抗性的影響時，發(fā)現(xiàn)隨果膠酶濃度的增加，2種煙草對TMV的抗性也逐步增加，濃度超過100 U/mL后，其防病效果均在50%以上。在溫室溫度過高（35℃以上）時，果膠酶發(fā)酵液會對煙草葉片造成一定的傷害。

Sequeira[17]指出，激發(fā)子誘導處理后，寄主的誘導抗性表達需要一段時間的積累才能實現(xiàn)，即誘導抗性表達與誘導處理之間有一定的滯后性。以100 U/mL果膠酶噴霧誘導Xanthi-nc煙葉片，前后不同時間接種TMV，結果表明，2、4 d接種TMV的植株，對枯斑數(shù)的抑制效果最為明顯，枯斑抑制率分別為49.54%和52.75%。由此也說明，果膠酶液對TMV無治療作用，它對TMV的防治作用是通過誘導煙草自身產(chǎn)生的防御反應來實現(xiàn)的。研究結果還表明，果膠酶液對TMV致病性無影響，從而進一步驗證了果膠酶對TMV的防效是通過誘導植物自身抗病防御機制來實現(xiàn)的。兩次加強誘導既可以提高誘導抗病效果，還可以延長誘導抗病效果的持續(xù)時間。

果膠酶誘導煙草對TMV的系統(tǒng)抗性試驗結果表明，果膠酶既可誘導煙草對TMV的局部抗性，又可誘導對TMV的系統(tǒng)抗性，且離處理葉越遠，誘導效果相對越低。該結果與果膠酶對黃瓜抗黑星病的作用不同，在黃瓜植株上，果膠酶不表現(xiàn)系統(tǒng)誘導抗病效果[10]。endprint

采用的誘導方法不同對果膠酶誘導抗性的發(fā)揮有很大影響，本試驗結果表明，以葉片噴霧法處理黃化苗的誘導效果最好，果膠酶葉柄注射對Xanthi-nc煙抗TMV有一定的誘導效果，灌根處理的誘導抗TMV效果不明顯。

總之，對果膠酶誘導抗病的機制及誘導抗性范圍，仍有許多工作有待于深入開展，以便為其實際開發(fā)應用提供理論基礎和技術支持。

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收稿日期：2014-01-03

基金項目：山東省現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系小麥創(chuàng)新團隊和國家自然科學青年基金（31301320）資助。endprint

采用的誘導方法不同對果膠酶誘導抗性的發(fā)揮有很大影響，本試驗結果表明，以葉片噴霧法處理黃化苗的誘導效果最好，果膠酶葉柄注射對Xanthi-nc煙抗TMV有一定的誘導效果，灌根處理的誘導抗TMV效果不明顯。

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收稿日期：2014-01-03

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采用的誘導方法不同對果膠酶誘導抗性的發(fā)揮有很大影響，本試驗結果表明，以葉片噴霧法處理黃化苗的誘導效果最好，果膠酶葉柄注射對Xanthi-nc煙抗TMV有一定的誘導效果，灌根處理的誘導抗TMV效果不明顯。

總之，對果膠酶誘導抗病的機制及誘導抗性范圍，仍有許多工作有待于深入開展，以便為其實際開發(fā)應用提供理論基礎和技術支持。

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收稿日期：2014-01-03

基金項目：山東省現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系小麥創(chuàng)新團隊和國家自然科學青年基金（31301320）資助。endprint