1種快速檢測(cè)乳及乳制品中皮革水解蛋白的方法

許曄+宋亮

摘要：在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白對(duì)乳及乳制品的生產(chǎn)和消費(fèi)產(chǎn)生很大負(fù)面影響，引起社會(huì)各方關(guān)注，為保證乳及乳制品的質(zhì)量安全，急需快速、簡(jiǎn)便的民用檢測(cè)乳及乳制品中是否含有皮革水解蛋白。本研究建立了乳及乳制品中皮革水解蛋白檢測(cè)方法，該方法中樣品無(wú)需進(jìn)行前處理，2 mL乳及乳制品中加入2 mL硫酸，100 ℃水浴 6.5 min 進(jìn)行顯色反應(yīng)。結(jié)果表明，該方法對(duì)乳及乳制品中皮革水解蛋白最低檢測(cè)限為0.25 mg/mL，滿足簡(jiǎn)便、快速的定性分析要求。

關(guān)鍵詞：乳；乳制品；皮革水解蛋白；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)： R155.5+7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0264-02

收稿日期：2013-06-18

作者簡(jiǎn)介：許曄（1980—），男，江蘇常州人，博士，講師，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：cukexu@gmail.com。蛋白質(zhì)是乳及乳制品中的主要營(yíng)養(yǎng)成分，但是一些不法企業(yè)為謀取暴利，在乳及乳制品中添加有機(jī)化工原料、不合法的動(dòng)植物蛋白等，以提高蛋白質(zhì)含量。近年來(lái)，媒體頻繁報(bào)道的“皮革奶”事件讓乳品產(chǎn)業(yè)受到一次次重創(chuàng)[1]。摻假乳會(huì)直接引起食品安全問(wèn)題，影響奶農(nóng)、生產(chǎn)廠家和消費(fèi)者的利益[2-3]。在常規(guī)檢測(cè)牛奶中蛋白含量時(shí)，結(jié)果是乳制品中總蛋白質(zhì)含量，而不是乳制品中乳蛋白的實(shí)際含量[2-3]，而皮革水解蛋白與三聚氰胺不同的是，它由皮革經(jīng)過(guò)化學(xué)、生物技術(shù)處理，水解出原有的蛋白（膠原蛋白），是真正的蛋白質(zhì)。所以，皮革水解蛋白添加在乳及乳制品中更為隱蔽，檢測(cè)難度更大。

若是較為純凈的皮革水解蛋白被人服用后傷害不大，而不法商販?zhǔn)菍⑸a(chǎn)皮衣、皮沙發(fā)、皮包等皮革下角料進(jìn)行化學(xué)、生物水解后制得的皮革水解產(chǎn)物添加到兌了水的牛奶中以提高蛋白含量，而鞣質(zhì)皮革下角廢料中含有重金屬鉻（VI），含有鉻離子的牛奶被人服用后，可造成人體重金屬中毒，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疏松、關(guān)節(jié)腫大。近期國(guó)家衛(wèi)生部已將皮革水解蛋白公布為食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種（第二批）[4-5]。

目前，檢測(cè)乳制品中是否添加皮革水解蛋白的常規(guī)方法有顯色環(huán)法[6]、超聲乳成分分析法[7]、石墨爐原子法[8]、比色法[9]、高效液相色譜法[10]、離子交換色譜一積分脈沖安培法[11]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法[12]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[13]和氨基酸自動(dòng)分析儀法[14]。常見(jiàn)的檢測(cè)方法大都為定量分析，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不利于普通百姓用于快速簡(jiǎn)便定性檢測(cè)。目前皮革奶定性分析方法僅有顯色環(huán)法[6]，但該方法需要水浴濃縮，耗時(shí)較長(zhǎng)。本研究試圖建立乳及乳制品中皮革水解蛋白簡(jiǎn)便快速的定性檢測(cè)方法，利于普通百姓在日常生活中對(duì)乳及乳制品中是否添加皮革水解蛋白進(jìn)行簡(jiǎn)便定性檢測(cè)，為乳與乳制品監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

皮革水解蛋白粉（蛋白質(zhì)含量78%），特侖蘇純牛奶（經(jīng)過(guò)GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》[9]的方法未測(cè)出水解蛋白，為合格乳，蛋白含量31%）。以上材料的蛋白質(zhì)含量均由凱氏定氮法[15-16]測(cè)得。

正常牛奶每100 mL約含有蛋白質(zhì)3.4 g、脂肪1.3 g（考慮到直接添加脂肪與水不容且脫脂奶中無(wú)脂肪，以下的模擬皮革奶中未加入脂肪），碳水化合物（主要是乳糖）5.0 g，根據(jù)以上配比取0.43 g的皮革水解蛋白（蛋白含量約為0.34 g），加入10 mL蒸餾水，0.5 g的乳糖，混合均勻再與15 mL的合格乳樣混勻（提高合格乳添加量可保證皮革水解蛋白充分溶解）。最終制得的添加皮革水解蛋白粉的自制皮革奶25 mL。用皮革水解蛋白制得的皮革奶自制樣外觀與正常牛奶一樣，乳白色，無(wú)異味，且經(jīng)凱氏定氮操作測(cè)得蛋白含量與合格乳相近（蛋白含量大于2.95%為合格乳）。

1.2方法

1.2.1試劑配置硫酸溶液的濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L。

1.2.2溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響在3支試管中分別加入 4 mL 皮革奶和2 mL 3 mol/L硫酸，分別放入80、90、100 ℃溫度的水浴中，記錄不同水浴溫度下開(kāi)始顯色的時(shí)間。

1.2.3硫酸濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響在7支試管中各加入皮革奶4 mL和2 mL不同濃度硫酸溶液，另取1支試管加入2 mL正常奶及2 mL蒸餾水，混勻后再加入2 mL 3.0 mol/L 的硫酸溶液，該試管作為空白管。將8支試管放置于100 ℃水浴，記錄不同試管顯粉紅色的時(shí)間。

1.2.4皮革奶顯色檢出限在7支試管中各加入2 mL不同濃度（皮革奶中皮革水解蛋白粉含量分別為30、20、10、5、1、05、0.1、0.05 mg/mL）的皮革奶和2 mL 3.0 mol/L硫酸溶液，另取1支試管加入2 mL正常奶與2 mL 3 mol/L 硫酸，分別放入100 ℃水浴中，記錄皮革水解蛋白不同濃度皮革奶在10 min內(nèi)顯粉紅色的程度。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響

由表1可見(jiàn)，水浴溫度越高，顯色越明顯；水浴溫度越高，顯色時(shí)間越短。100 ℃水浴條件下顯色時(shí)間比80 ℃水浴條件下顯色時(shí)間短356 min。

2.2硫酸濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響

由表2可知，皮革奶顯色所需時(shí)間隨硫酸濃度提高而縮短，使用3.0 mol/L硫酸的顯色時(shí)間只需要209 s，僅為使用0.5 mol/L硫酸所需時(shí)間的38.63%。

2.3皮革奶顯色檢出限

由表3可見(jiàn)，當(dāng)皮革奶中皮革水解蛋白粉添加量為 0.25 mg/mL 時(shí)，顯色開(kāi)始不明顯，此時(shí)皮革奶中皮革粉濃度為 0.25 mg/mL。

3討論endprint

用酸法單獨(dú)水解制皮革水解蛋白粉及牛奶中添加皮革水解蛋白粉制皮革奶時(shí)可以觀察到，皮革水解蛋白粉在酸性條件下自身會(huì)水解為淡粉紅色混合物，而混有皮革水解蛋白粉的乳樣加酸后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的高溫水浴，會(huì)呈現(xiàn)更深的粉紅色，而正常奶加酸水浴，則不會(huì)呈現(xiàn)粉紅色。該顯色方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，試劑簡(jiǎn)單，操作方便，可以初步判斷乳樣中是否添加了皮革粉。

由溫度對(duì)顯色的影響試驗(yàn)可以看出，水浴溫度越高，顯色越明顯，顯色時(shí)間越短，考慮操作的方便與簡(jiǎn)便，建議水浴溫度為100 ℃。通過(guò)酸濃度對(duì)顯色的影響試驗(yàn)可以看出，硫酸濃度越高，顯色越明顯，顯色所需時(shí)間越短，為考慮到安全性及顯色時(shí)效性，建議硫酸濃度取2 mol/L。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明，皮革奶中皮革水解蛋白的最低檢出限為0.25 mg/mL。

當(dāng)水浴溫度為100 ℃，酸的濃度取2 mol/L，經(jīng)過(guò)382 s，皮革奶直接顯色，達(dá)到快速簡(jiǎn)便檢測(cè)的效果。而傳統(tǒng)的比色法判斷乳樣中是否添加了皮革水解蛋白必須先將乳樣進(jìn)行水解使其游離出特征氨基酸L-羥脯氨酸，然后進(jìn)行氧化再與顯色劑反應(yīng)顯色，該方法對(duì)于定性定量判斷乳樣是否為皮革奶雖然可靠穩(wěn)定，但涉及到水解步驟，適于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，而其他檢測(cè)皮革水解蛋白的方法如色譜法及其他儀器檢測(cè)法都涉及昂貴的儀器，對(duì)樣品的前期及后期處理較為繁瑣，且操作要求高，不適于民用，而本研究建立的直接顯色法操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器要求很低，所用試劑和儀器為2 mol/L的硫酸和試管，適于民用檢測(cè)。當(dāng)然，該方法只能對(duì)于添加皮革水解蛋白的皮革奶進(jìn)行檢測(cè)，若乳樣中添加豬皮粉或者動(dòng)物水解蛋白，那么該方法的靈敏性較差，但考慮到豬皮粉較貴不適于作為動(dòng)物蛋白添加劑，而動(dòng)物水解蛋白大多是有鹽酸水解中和而來(lái)，顏色為棕黃色且其中的氯離子也容易檢測(cè)不適于作為蛋白添加劑，所以本研究建立的直接顯色法有一定的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

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[16]郭穎娜，孫衛(wèi). 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較[J]. 河北化工，2008，31（4）：36-37.endprint

用酸法單獨(dú)水解制皮革水解蛋白粉及牛奶中添加皮革水解蛋白粉制皮革奶時(shí)可以觀察到，皮革水解蛋白粉在酸性條件下自身會(huì)水解為淡粉紅色混合物，而混有皮革水解蛋白粉的乳樣加酸后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的高溫水浴，會(huì)呈現(xiàn)更深的粉紅色，而正常奶加酸水浴，則不會(huì)呈現(xiàn)粉紅色。該顯色方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，試劑簡(jiǎn)單，操作方便，可以初步判斷乳樣中是否添加了皮革粉。

由溫度對(duì)顯色的影響試驗(yàn)可以看出，水浴溫度越高，顯色越明顯，顯色時(shí)間越短，考慮操作的方便與簡(jiǎn)便，建議水浴溫度為100 ℃。通過(guò)酸濃度對(duì)顯色的影響試驗(yàn)可以看出，硫酸濃度越高，顯色越明顯，顯色所需時(shí)間越短，為考慮到安全性及顯色時(shí)效性，建議硫酸濃度取2 mol/L。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明，皮革奶中皮革水解蛋白的最低檢出限為0.25 mg/mL。

當(dāng)水浴溫度為100 ℃，酸的濃度取2 mol/L，經(jīng)過(guò)382 s，皮革奶直接顯色，達(dá)到快速簡(jiǎn)便檢測(cè)的效果。而傳統(tǒng)的比色法判斷乳樣中是否添加了皮革水解蛋白必須先將乳樣進(jìn)行水解使其游離出特征氨基酸L-羥脯氨酸，然后進(jìn)行氧化再與顯色劑反應(yīng)顯色，該方法對(duì)于定性定量判斷乳樣是否為皮革奶雖然可靠穩(wěn)定，但涉及到水解步驟，適于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，而其他檢測(cè)皮革水解蛋白的方法如色譜法及其他儀器檢測(cè)法都涉及昂貴的儀器，對(duì)樣品的前期及后期處理較為繁瑣，且操作要求高，不適于民用，而本研究建立的直接顯色法操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器要求很低，所用試劑和儀器為2 mol/L的硫酸和試管，適于民用檢測(cè)。當(dāng)然，該方法只能對(duì)于添加皮革水解蛋白的皮革奶進(jìn)行檢測(cè)，若乳樣中添加豬皮粉或者動(dòng)物水解蛋白，那么該方法的靈敏性較差，但考慮到豬皮粉較貴不適于作為動(dòng)物蛋白添加劑，而動(dòng)物水解蛋白大多是有鹽酸水解中和而來(lái)，顏色為棕黃色且其中的氯離子也容易檢測(cè)不適于作為蛋白添加劑，所以本研究建立的直接顯色法有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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用酸法單獨(dú)水解制皮革水解蛋白粉及牛奶中添加皮革水解蛋白粉制皮革奶時(shí)可以觀察到，皮革水解蛋白粉在酸性條件下自身會(huì)水解為淡粉紅色混合物，而混有皮革水解蛋白粉的乳樣加酸后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的高溫水浴，會(huì)呈現(xiàn)更深的粉紅色，而正常奶加酸水浴，則不會(huì)呈現(xiàn)粉紅色。該顯色方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，試劑簡(jiǎn)單，操作方便，可以初步判斷乳樣中是否添加了皮革粉。

由溫度對(duì)顯色的影響試驗(yàn)可以看出，水浴溫度越高，顯色越明顯，顯色時(shí)間越短，考慮操作的方便與簡(jiǎn)便，建議水浴溫度為100 ℃。通過(guò)酸濃度對(duì)顯色的影響試驗(yàn)可以看出，硫酸濃度越高，顯色越明顯，顯色所需時(shí)間越短，為考慮到安全性及顯色時(shí)效性，建議硫酸濃度取2 mol/L。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明，皮革奶中皮革水解蛋白的最低檢出限為0.25 mg/mL。

當(dāng)水浴溫度為100 ℃，酸的濃度取2 mol/L，經(jīng)過(guò)382 s，皮革奶直接顯色，達(dá)到快速簡(jiǎn)便檢測(cè)的效果。而傳統(tǒng)的比色法判斷乳樣中是否添加了皮革水解蛋白必須先將乳樣進(jìn)行水解使其游離出特征氨基酸L-羥脯氨酸，然后進(jìn)行氧化再與顯色劑反應(yīng)顯色，該方法對(duì)于定性定量判斷乳樣是否為皮革奶雖然可靠穩(wěn)定，但涉及到水解步驟，適于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，而其他檢測(cè)皮革水解蛋白的方法如色譜法及其他儀器檢測(cè)法都涉及昂貴的儀器，對(duì)樣品的前期及后期處理較為繁瑣，且操作要求高，不適于民用，而本研究建立的直接顯色法操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器要求很低，所用試劑和儀器為2 mol/L的硫酸和試管，適于民用檢測(cè)。當(dāng)然，該方法只能對(duì)于添加皮革水解蛋白的皮革奶進(jìn)行檢測(cè)，若乳樣中添加豬皮粉或者動(dòng)物水解蛋白，那么該方法的靈敏性較差，但考慮到豬皮粉較貴不適于作為動(dòng)物蛋白添加劑，而動(dòng)物水解蛋白大多是有鹽酸水解中和而來(lái)，顏色為棕黃色且其中的氯離子也容易檢測(cè)不適于作為蛋白添加劑，所以本研究建立的直接顯色法有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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