衡陽地區(qū)萵筍葉斑病病原菌的鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選

李玉中+楊芳+劉春+滕濤+何麗芳

摘要：對(duì)衡陽地區(qū)的萵筍葉斑病病原菌進(jìn)行了分離和形態(tài)學(xué)鑒定，并采用平皿菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定供試藥劑對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，比較了4種殺菌劑對(duì)致病菌的抑制效果，結(jié)果表明：衡陽地區(qū)萵筍葉斑病致病菌為微疣匍柄霉[Stemphylium chisha （Nish） Yannamoto]，在供試藥劑中甲霜·錳鋅、代森錳鋅的抑菌效果較好，EC50分別為6.58、634 mg/L；其次是多菌靈，其EC50為458 mg/L；最后是百菌清，其EC50 為2 107 mg/L。

關(guān)鍵詞：萵筍葉斑病；藥劑篩選；生長(zhǎng)抑制；菌落直徑

中圖分類號(hào)： S436.36文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0102-03

收稿日期：2013-06-07

基金項(xiàng)目：湖南省衡陽市科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2011KN12）。

作者簡(jiǎn)介：李玉中（1978—），男，山東聊城人，博士，副教授，主要從事微生物及植物病害防治等方面的研究。E-mail：yzl_2002@163.com。萵筍（Lactuca sativa）為菊科（Compositaeaceae）1年生或2年生草本植物，在我國(guó)各地普遍栽培。萵筍肉質(zhì)細(xì)嫩，常吃萵筍可增強(qiáng)胃液和消化液分泌，增進(jìn)膽汁分泌。萵筍含豐富的鉀、氟元素及胡蘿卜素，可為人提供豐富的營(yíng)養(yǎng)。此外，萵筍葉還具有一定的平咳作用[1]。萵筍在我國(guó)的種植面積越來越大，同時(shí)其病害的發(fā)生及其造成的經(jīng)濟(jì)損失也在增大，尤其是萵筍葉斑病[2]。本研究對(duì)湖南省衡陽地區(qū)萵筍葉斑病的病原菌進(jìn)行了分離、純化、鑒定和藥劑篩選，以期找出防治萵筍病害的最佳藥劑，為衡陽地區(qū)萵筍葉斑病的防治提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株分離自衡陽地區(qū)尖葉青筍發(fā)病的典型葉片上的病原菌。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑PDA：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L；0.1%的HgCl2消毒液；參照方中達(dá)方法[3]配制。

試驗(yàn)藥劑：（1）純品多菌靈可濕性粉劑（山東富先達(dá)農(nóng)藥有限公司）；（2）70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（珠海凱特生物技術(shù)有限公司）；（3）75%百菌清可濕性粉劑（吉林力生農(nóng)化農(nóng)藥有限公司）；（4）進(jìn)口80%代森錳鋅可濕性粉劑（奧瑞特農(nóng)藥有限責(zé)任公司）；（5）72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑（重慶易豐科技發(fā)展有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品采集于衡陽市各地采集尖葉青筍上明顯發(fā)病病葉，將葉片裝入封口塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室待用。

1.2.2菌株的分離、純化與保存從采集的樣品中，選出具有典型病斑的葉片，以常規(guī)組織分離法[3]進(jìn)行分離。在每個(gè)葉片上分離3～5塊組織，每一病斑于病健交界處切取約 5 mm2 的病組織，然后用70%乙醇浸20～30 s，再在0.1%的酸性氯化汞水溶液中浸1～2 min，再用滅菌水換洗4次，置于PDA平板上，每皿接種4～5個(gè)葉斑。接種完畢后將其置于（25±1） ℃條件下培養(yǎng)。待病組織長(zhǎng)出菌絲后，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，選取菌絲一致的菌落，用接種針挑取菌株的周邊菌絲于新的PDA平板上于（25±1） ℃下培養(yǎng)4 d，將分離到的純種菌株接種試管斜面，于（25±1） ℃下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面，置 4 ℃ 冰箱保存待用。

1.2.3病原菌的鑒定將純化的菌株在PDA上培養(yǎng)7～10 d，挑取菌落組織，顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子的形態(tài)并拍照。根據(jù)形態(tài)參考《中國(guó)真菌志》第三十一卷暗色磚格分生孢子真菌的描述[4]對(duì)病菌進(jìn)行鑒定。

1.2.4藥劑篩選采用含藥平板法[5-7]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，供試藥劑的濃度如下：80%代森錳鋅和72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑6個(gè)濃度為：10、5、2.5、1.25、0.625、0312 5 mg/L；純品多菌靈為：5 000、1 667、556、185、62、21 mg/L；75%百菌清可濕性粉劑為10 000、3 333、1 111、370、123、41 mg/L。

將供試菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi) 25 ℃ 培養(yǎng)5～7 d，用打孔器打取直徑6 mm的菌餅接種于相應(yīng)濃度的含藥PDA平板培養(yǎng)基中央，每皿1枚，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，每種藥劑每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，以加等量無菌水的平板培養(yǎng)基為對(duì)照；4 d或7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，根據(jù)公式（1）計(jì)算各藥劑對(duì)病菌的抑制率，并通過DPS2000軟件對(duì)藥劑濃度和抑制率進(jìn)行毒力回歸方程分析和計(jì)算EC50。

生長(zhǎng)抑制率=對(duì)照直徑-處理直徑對(duì)照直徑-菌餅直徑×100%（1）

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的鑒定

萵筍發(fā)病病葉上出現(xiàn)紅棕色至暗褐色壞死斑，中間有灰白色點(diǎn)，以其為中心有輪紋，整個(gè)病斑有圓形、近圓形或不規(guī)則形，直徑為2～8 mm，每張葉片上出現(xiàn)的病斑數(shù)目不等，少的幾個(gè)，多的十幾個(gè)甚至幾十個(gè)（圖1-A）。分離純化的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落圓形或近圓形，厚實(shí)，初期呈灰白色，3～4 d逐漸變?yōu)榛液志G色。整個(gè)菌落外圍灰白色至暗青褐色，由外往內(nèi)菌絲顏色逐漸加深，直至菌落中央的黑褐色，但接種點(diǎn)因長(zhǎng)有較多氣生菌絲為灰白色（圖1-B）。顯微鏡下觀察顯示，該菌菌絲細(xì)長(zhǎng)，有分枝，菌絲直徑為2.0～3.0 μm；分生孢子梗單生，頂端色稍淡，基部細(xì)胞稍大，頂端較寬，呈截形，分生孢子橢圓形或卵形，單生，淡褐色至褐色，無嘴喙，有縱橫分隔，成熟孢子表面有細(xì)疣（圖1-C、D）。根據(jù)以上形態(tài)特征，可知衡陽地區(qū)萵筍葉斑病的病原菌為微疣匍柄霉[Stemphylium chisha （Nish） Yannamoto]。

2.24種藥劑對(duì)病菌的抑制效果

藥劑處理葉斑病菌絲培養(yǎng)7 d后，結(jié)果顯示：在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，甲霜·錳鋅和代森錳鋅最高抑制率分別為59.68%和58.87%；而藥劑處理4 d的多菌靈、百菌清的最高抑制率分別為88.89%、80.56%（表1）。由此可知，所試各種濃度的藥劑對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)都有不同程度的抑制作用。通過DPS2000軟件對(duì)藥劑濃度和抑制率進(jìn)行相關(guān)性數(shù)據(jù)分析，得出甲霜·錳鋅、代森錳鋅、多菌靈和百菌清回歸方程并計(jì)算出各個(gè)藥劑的抑制中濃度分別為6.58、6.34、 458、2 107 mg/L （表2）。由此可知，在對(duì)萵筍葉斑病測(cè)試的4種藥劑中，代森錳鋅的抑菌效果最好，其次是甲霜·錳鋅，再次是多菌靈，最差的為百菌清。所以，4種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力大小次序?yàn)椋捍i鋅>甲霜·錳鋅>多菌靈>百菌清（圖2）。表1殺菌劑對(duì)萵筍葉斑病菌絲生長(zhǎng)的影響endprint

3結(jié)論與討論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)引起萵筍葉斑病的病原菌主要是微疣匍柄霉。藥劑篩選表明，代森錳鋅和甲霜·錳鋅對(duì)該病菌的抑制中濃度要遠(yuǎn)小于百菌清和多菌靈。本研究結(jié)果為萵筍葉斑病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

在對(duì)衡陽地區(qū)果蔬主要病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)的萵筍葉部病害發(fā)生嚴(yán)重，成為影響萵筍產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[2]。目前防治萵筍葉斑病推薦使用的農(nóng)藥為75%百菌清、50%異菌脲、40%克菌丹、50%甲基硫菌靈可濕粉劑[8]等，而本研究顯示代森錳鋅和甲霜·錳鋅同推薦藥劑百菌清相比效果更好。造成結(jié)果不一致的原因可能有兩個(gè)：一是不同地區(qū)的萵筍葉斑病病菌的對(duì)不同藥劑的敏感度存在差異；二是百菌清藥劑的長(zhǎng)期使用使得萵筍葉斑病對(duì)其產(chǎn)生了部分抗性。由此看來，今后在防治萵筍葉斑病過程中，有必要對(duì)本試驗(yàn)藥劑進(jìn)行進(jìn)一步的田間驗(yàn)證試驗(yàn)，找出更經(jīng)濟(jì)有效的藥劑，用于萵筍葉斑病害的防治，以降低藥劑用量，減少環(huán)境污染和防止病原菌抗藥性的產(chǎn)生。

在本試驗(yàn)中，代森錳鋅和甲霜·錳鋅處理組是測(cè)定處理 7 d 的菌落直徑，而百菌清和多菌靈處理組是測(cè)定處理4 d的菌落直徑，是因?yàn)樵陬A(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，百菌清和多菌靈藥劑處理菌絲4 d以后對(duì)菌絲的抑制率基本保持不變，因此對(duì)于EC50的計(jì)算沒有影響。另外，在藥劑預(yù)試驗(yàn)中還測(cè)試70%甲基硫菌靈，發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)萵筍葉斑病無抑制效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]李忠瓊，林瑞超，傅文，等. 萵筍花化學(xué)成分的研究[J]. 中草藥，2001，32（2）：101-104.

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[4]張?zhí)煊? 中國(guó)真菌志：第三十一卷暗色磚格分生孢子真菌26屬[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社，2009：198-199.

[5]楊成德，姜紅霞，陳秀蓉，等. 甘肅省馬鈴薯炭疽病的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 植物保護(hù)，2012，38（6）：127-133.

[6]陳愛昌，魏周全，駱得功，等. 馬鈴薯炭疽病發(fā)生情況及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 植物保護(hù)，2012，38（5）：162-164.

[7]張瑾，徐秉良，梁巧蘭，等. 杏采后病害病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 植物保護(hù)，2011，37（5）：118-123.

[8]黃華寧. 萵筍病蟲害防治不容忽視[J]. 科學(xué)種養(yǎng)，2009（4）：30.endprint

3結(jié)論與討論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)引起萵筍葉斑病的病原菌主要是微疣匍柄霉。藥劑篩選表明，代森錳鋅和甲霜·錳鋅對(duì)該病菌的抑制中濃度要遠(yuǎn)小于百菌清和多菌靈。本研究結(jié)果為萵筍葉斑病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

在對(duì)衡陽地區(qū)果蔬主要病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)的萵筍葉部病害發(fā)生嚴(yán)重，成為影響萵筍產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[2]。目前防治萵筍葉斑病推薦使用的農(nóng)藥為75%百菌清、50%異菌脲、40%克菌丹、50%甲基硫菌靈可濕粉劑[8]等，而本研究顯示代森錳鋅和甲霜·錳鋅同推薦藥劑百菌清相比效果更好。造成結(jié)果不一致的原因可能有兩個(gè)：一是不同地區(qū)的萵筍葉斑病病菌的對(duì)不同藥劑的敏感度存在差異；二是百菌清藥劑的長(zhǎng)期使用使得萵筍葉斑病對(duì)其產(chǎn)生了部分抗性。由此看來，今后在防治萵筍葉斑病過程中，有必要對(duì)本試驗(yàn)藥劑進(jìn)行進(jìn)一步的田間驗(yàn)證試驗(yàn)，找出更經(jīng)濟(jì)有效的藥劑，用于萵筍葉斑病害的防治，以降低藥劑用量，減少環(huán)境污染和防止病原菌抗藥性的產(chǎn)生。

在本試驗(yàn)中，代森錳鋅和甲霜·錳鋅處理組是測(cè)定處理 7 d 的菌落直徑，而百菌清和多菌靈處理組是測(cè)定處理4 d的菌落直徑，是因?yàn)樵陬A(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，百菌清和多菌靈藥劑處理菌絲4 d以后對(duì)菌絲的抑制率基本保持不變，因此對(duì)于EC50的計(jì)算沒有影響。另外，在藥劑預(yù)試驗(yàn)中還測(cè)試70%甲基硫菌靈，發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)萵筍葉斑病無抑制效果。

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[8]黃華寧. 萵筍病蟲害防治不容忽視[J]. 科學(xué)種養(yǎng)，2009（4）：30.endprint

3結(jié)論與討論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)引起萵筍葉斑病的病原菌主要是微疣匍柄霉。藥劑篩選表明，代森錳鋅和甲霜·錳鋅對(duì)該病菌的抑制中濃度要遠(yuǎn)小于百菌清和多菌靈。本研究結(jié)果為萵筍葉斑病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

在對(duì)衡陽地區(qū)果蔬主要病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)的萵筍葉部病害發(fā)生嚴(yán)重，成為影響萵筍產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[2]。目前防治萵筍葉斑病推薦使用的農(nóng)藥為75%百菌清、50%異菌脲、40%克菌丹、50%甲基硫菌靈可濕粉劑[8]等，而本研究顯示代森錳鋅和甲霜·錳鋅同推薦藥劑百菌清相比效果更好。造成結(jié)果不一致的原因可能有兩個(gè)：一是不同地區(qū)的萵筍葉斑病病菌的對(duì)不同藥劑的敏感度存在差異；二是百菌清藥劑的長(zhǎng)期使用使得萵筍葉斑病對(duì)其產(chǎn)生了部分抗性。由此看來，今后在防治萵筍葉斑病過程中，有必要對(duì)本試驗(yàn)藥劑進(jìn)行進(jìn)一步的田間驗(yàn)證試驗(yàn)，找出更經(jīng)濟(jì)有效的藥劑，用于萵筍葉斑病害的防治，以降低藥劑用量，減少環(huán)境污染和防止病原菌抗藥性的產(chǎn)生。

在本試驗(yàn)中，代森錳鋅和甲霜·錳鋅處理組是測(cè)定處理 7 d 的菌落直徑，而百菌清和多菌靈處理組是測(cè)定處理4 d的菌落直徑，是因?yàn)樵陬A(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，百菌清和多菌靈藥劑處理菌絲4 d以后對(duì)菌絲的抑制率基本保持不變，因此對(duì)于EC50的計(jì)算沒有影響。另外，在藥劑預(yù)試驗(yàn)中還測(cè)試70%甲基硫菌靈，發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)萵筍葉斑病無抑制效果。

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[8]黃華寧. 萵筍病蟲害防治不容忽視[J]. 科學(xué)種養(yǎng)，2009（4）：30.endprint