一種簡易觀察管花肉蓯蓉寄生過程的方法

張金霞　王華磊　郭玉?！〉灾鞠?/p>

摘要：木箱-玻璃板法可以在不傷害肉蓯蓉種子和檉柳根系的情況下，直觀地觀察到管花肉蓯蓉寄生的整個(gè)過程，建立一種可視的管花肉蓯蓉寄生的觀察方法，為進(jìn)一步明確管花肉蓯蓉寄生過程和寄生機(jī)理提供一種研究模型。

關(guān)鍵詞：管花肉蓯蓉；木箱-玻璃法；檉柳；寄生過程；寄生機(jī)理

中圖分類號： Q944.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0211-02

收稿日期：2013-06-04

基金項(xiàng)目：科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金（編號：2011GB23600014）；貴州省科技計(jì)劃[編號：黔科合院所創(chuàng)能（2010）4002]。

作者簡介：張金霞（1978—），女，河北邢臺人，碩士，助理研究員，從事中草藥栽培研究。E-mail：jx9801@126.com。

通信作者：郭玉海，教授，博士生導(dǎo)師，從事中草藥栽培研究。E-mail：yhguo@cau.edu.cn。管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa （Schenk）R.Wight]為列當(dāng)科的寄生植物，性甘、咸、溫，具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便的功效[1]。管花肉蓯蓉具有根寄生特性，其寄生過程在土壤中進(jìn)行，因此難以觀察它的生長過程。目前，國內(nèi)外的研究多側(cè)重于利用列當(dāng)愈傷組織離體侵染寄主體系的建立[2-3]，研究多集中于列當(dāng)屬植物侵染草本植物，由于管花肉蓯蓉的寄主檉柳是木本植物，侵染較困難，所以關(guān)于這方面的研究相對較少，其寄生關(guān)系也有待于進(jìn)一步深入研究。李天然等采用盆栽法收集了與梭梭根接種的、處于不同時(shí)期的種子萌發(fā)體[4]，最早研究了肉蓯蓉種子的萌發(fā)與寄主梭梭的關(guān)系。王華磊通過田間連續(xù)大量取樣，觀察了管花肉蓯蓉種子萌發(fā)、寄生于檉柳根、長出幼苗寄生過程的形態(tài)學(xué)變化[5]。馬東明采用無菌培養(yǎng)法建立了檉柳刺激管花肉蓯蓉種子萌發(fā)的技術(shù)[6]，在無菌狀態(tài)下研究管花肉蓯蓉接種檉柳的過程，由于培養(yǎng)基和土壤環(huán)境存在較大差異，因此采取田間采樣觀察管花肉蓯蓉萌發(fā)和寄生過程，對接種的管花肉蓯蓉進(jìn)行不定期采挖。由于采挖過程容易對管花肉蓯蓉和檉柳根系造成傷害，且僅限于用肉眼觀察，另外，管花肉蓯蓉種子非常小，采挖和觀察比較困難，所以管花肉蓯蓉寄生及生長所需適宜生態(tài)條件尚未研究清楚，難以對田間栽培進(jìn)行科學(xué)指導(dǎo)。生產(chǎn)中主要存在種源浪費(fèi)嚴(yán)重、接種率低、接種周期長等問題，本研究針對這些問題，建立了一種可視化觀察管花肉蓯蓉接種試驗(yàn)體系，突破了肉眼的限制，借助體視顯微鏡進(jìn)行觀察，在不傷害管花肉蓯蓉生長的情況下觀察管花肉蓯蓉的寄生過程。

1材料與方法

1.1供試材料

管花肉蓯蓉種子來源于新疆于田種植場。

1.2儀器

奧林巴斯 SZH-10型體視顯微鏡；20 cm×20 cm的木板2塊；20 cm×15 cm的木板3塊；有機(jī)透明玻璃板；白紗布。

1.3方法

1.3.1檉柳實(shí)生苗的培養(yǎng)取成熟的檉柳種子，將其均勻撒播在裝有濕潤沙土的花盆中，在花盆口覆蓋1層透明的塑料膜，在光照強(qiáng)度為1 600 lx、溫度為25 ℃下培養(yǎng)，待檉柳長出沙土2～3 cm將塑料膜揭去，待檉柳長至15～20 cm時(shí)備用。

1.3.2管花肉蓯蓉種子的前處理方法經(jīng)過初步分級的05～0.8 mm管花肉蓯蓉種子放置于2～5 ℃下低溫層積6個(gè)月，完成生理后熟。

1.3.3木箱-玻璃板法將木箱訂成簸箕狀，其中3個(gè)側(cè)面為長方形木板（20 cm×15 cm），2個(gè)正方形寬面（20 cm×20 cm ）中的一面安裝木板，另一面安裝可以開啟的玻璃門，將木箱開口和裝玻璃的一面斜向上放置，填入濕沙土至木箱的窄木板一半厚度，取株高達(dá)15～20 cm的檉柳實(shí)生苗2棵，剪掉一部分枝干，將檉柳根平鋪在濕沙中，此時(shí)檉柳放置方向與玻璃板保持一致。然后繼續(xù)用濕沙覆蓋住檉柳根部，將沙土表面壓實(shí)壓平整，在濕沙上鋪2層白紗布，以便檉柳根能穿過紗布生長，將透明玻璃板壓緊在紗布上。用黑布將玻璃板完全包裹起來，玻璃板朝向背光的一面，將箱體與水平夾角呈60° 傾斜向陽放置，這樣既能保證檉柳枝葉進(jìn)行光合作用，又能保證檉柳根部受重力作用垂直長出紗布，待檉柳根約穿透紗布面積的 1/2 時(shí)，將經(jīng)過6個(gè)月層積的管花肉蓯蓉種子放在檉柳根周圍的0～5 cm處，每棵檉柳根上放置60粒，置于光照強(qiáng)度為 1 600 lx、溫度為（25±2） ℃的條件下培養(yǎng)，10棵檉柳為1個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。定期用奧林巴斯 SZH-10型體視顯微鏡觀察種子萌發(fā)和接種于寄主根的情況，記錄并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1管花肉蓯蓉種子的萌發(fā)

采用木箱-玻璃板法，用濕沙土作介質(zhì)，將層積6個(gè)月的管花肉蓯蓉種子播種到檉柳根附近0～5 mm范圍內(nèi)，20 d左右開始萌發(fā)。李天然等發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉種子在鉆入種皮內(nèi)的寄主根的誘發(fā)下萌發(fā)，其種胚細(xì)胞伸長形成管狀突起[4]。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)管花肉蓯蓉有另外一種萌發(fā)方式，即在未觸及管花肉蓯蓉種子時(shí)，檉柳根附近的管花肉蓯蓉種子就開始萌發(fā)，且越靠近檉柳根區(qū)0～5 mm范圍內(nèi)的管花肉蓯蓉種子萌發(fā)越多，管花肉蓯蓉的芽管狀器官比較粗壯，說明檉柳的新生毛細(xì)根尖會釋放出某種化學(xué)物質(zhì)，刺激管花肉蓯蓉種子種胚細(xì)胞分裂，進(jìn)而促進(jìn)其萌發(fā)。隨后芽管狀器官逐漸發(fā)育出具乳頭狀突起的初生吸器，膨大的初生吸器表皮有許多褶皺，其前端呈現(xiàn)出淡黃色或乳白色透明狀，芽管狀器官發(fā)育出乳突狀物。管花肉蓯蓉的萌發(fā)過程經(jīng)歷了由初生吸器逐漸發(fā)育出次生吸器階段，吸器的發(fā)生是寄主植物能否建立寄生關(guān)系的關(guān)鍵。

2.2管花肉蓯蓉入侵檉柳根的形態(tài)變化

管花肉蓯蓉種子從萌發(fā)到侵入檉柳根木質(zhì)部約需10 d，在體視顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)管花肉蓯蓉膨大的乳頭狀突起（圖1）頭部出現(xiàn)了淡黃色的分泌物，此現(xiàn)象在小列當(dāng)和大麻列當(dāng)愈傷組織上曾經(jīng)報(bào)道過[7]。但其化學(xué)成分有待于進(jìn)一步鑒定，初步推測為一些水解酶類物質(zhì)，能促使檉柳根細(xì)胞壁溶解，以便于管花肉蓯蓉侵入寄主根部。多數(shù)管花肉蓯蓉種子芽管狀器官一旦接觸到寄主根，芽管狀器官即停止伸長，其頭部形成膨大的具乳突狀物器官，芽管狀器官端分泌一些酶類物質(zhì)侵入寄主皮層。一旦管花肉蓯蓉吸器的導(dǎo)管和檉柳根系的導(dǎo)管相連接（圖2），管花肉蓯蓉就可以從寄主木質(zhì)部攝取水分和無機(jī)鹽，滿足自身生長需求。

2.3管花肉蓯蓉寄生檉柳根部形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)

在顯微鏡下對管花肉蓯蓉、檉柳接合處的石蠟切片進(jìn)行觀察（圖3），結(jié)果顯示，管花肉蓯蓉莖的結(jié)構(gòu)為草本雙子葉植物莖結(jié)構(gòu)，由表皮、皮層、維管組織組成。管花肉蓯蓉的吸器均由大量長方形薄壁細(xì)胞和螺紋導(dǎo)管組成。吸器與寄主檉柳木質(zhì)部接觸處為多數(shù)體積小、細(xì)胞質(zhì)濃的薄壁細(xì)胞和螺紋導(dǎo)管，細(xì)胞核小而多，吸器的導(dǎo)管與檉柳根的導(dǎo)管相連接，由這些細(xì)胞從寄主木質(zhì)部攝取水分和無機(jī)鹽，再由吸器薄壁組織轉(zhuǎn)運(yùn)到吸器導(dǎo)管輸送到莖和葉，形成一個(gè)輸送水溶液的通道。

3小結(jié)

關(guān)于管花肉蓯蓉種子萌發(fā)與寄生生理方面的研究還很薄弱，很多問題尚待研究。采用木箱-玻璃板法研究管花肉蓯蓉與檉柳的接種過程，能明確管花肉蓯蓉種子從萌發(fā)到寄生的整個(gè)生長階段，對每個(gè)生長階段的管花肉蓯蓉和檉柳進(jìn)行形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察，以明確管花肉蓯蓉吸器的生長發(fā)育、寄生時(shí)間、寄生距離和寄生的主動(dòng)性等問題，從而提高肉蓯蓉田間接種率和接種同步性，避免了只有通過人工采挖才能確定管花肉蓯蓉寄生過程的盲目性。該方法操作簡單，在室內(nèi)即可進(jìn)行，條件可控，適用于工廠化生產(chǎn)管花肉蓯蓉-檉柳復(fù)合苗，對管花肉蓯蓉高效接種技術(shù)的形成具有重要意義，對進(jìn)一步探索寄生植物寄生過程與寄生機(jī)理具有一定的理論和實(shí)踐價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會. 中國藥典：一部[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]Baird W V，Riopel J L. Experimental studies of the attanchment of the parasitic angiosperm Agalinis purpurea to a host[J]. Protoplasma，1983，118：206.

[3]Lane J A，Bailey J A，Terry P J. In-vitro growth system for studying the parasitism of cowpea（Vigna unguiculata）by striga gesnerioides[J]. Weed Research，1991，31（4）：211-217.

[4]李天然，許月英，戈建新，等. 肉蓯蓉（Cistanche deserticola Ma）種子的萌發(fā)及與寄主梭梭（Halaxylon ammodenron Bunge）的關(guān)系[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1989，20（3）：395-400.

[5]王華磊，楊太新，楊重軍，等. 管花肉蓯蓉種子萌發(fā)和寄生過程的形態(tài)學(xué)研究[J]. 中國中藥雜志，2005，30（23）：1812-1814.

[6]馬東明，楊太新，陳慶亮，等. 管花肉蓯蓉與檉柳試管苗離體接種的研究[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2005，22（6）：687-691.

[7]Zhou W J，Yoneyama K，Takeuchi Y，et al. In vitro infection of host roots by differentiated calli of the parasitic plant Orobanche[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55（398）：899-907.成明超，李丹霞，王康才，等. 5個(gè)藥用菊花品種類型主要化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)累積[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：213-215.