海洋微藻的玻璃化凍存技術(shù)研究進(jìn)展

林小園　劉紅全　袁衛(wèi)生

摘要：微藻的營養(yǎng)豐富，在生活和生產(chǎn)實(shí)踐中備受研究者的親睞，但由于海洋微藻的長時(shí)間培養(yǎng)和多次接種易導(dǎo)致藻種污染或遺傳漂變，使微藻的科研工作和商業(yè)化開發(fā)受到極大的限制。因此有效的藻種保存方法是進(jìn)一步研究和開發(fā)利用海洋微藻的關(guān)鍵。玻璃化保存技術(shù)是一門新興的生物技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效等特點(diǎn)，是目前海洋微藻種質(zhì)資源長期穩(wěn)定保存的理想方法。現(xiàn)對(duì)玻璃化法超低溫保存的原理、優(yōu)點(diǎn)，玻璃化凍存法的操作程序、影響因素、關(guān)鍵技術(shù)和海洋微藻凍存苗的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，并對(duì)其今后的發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：海洋微藻；玻璃化凍存；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S917.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0190-05

收稿日期：2013-05-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30960215）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：桂科青0728019）。

作者簡介：林小園（1989—），女，碩士研究生，主要從事海洋微藻的種質(zhì)保存及多不飽和脂肪酸研究。E-mail：lxyqzw@126.com。

通信作者：劉紅全，副教授。E-mail：lhongquan@163.com。近年來，隨著陸地資源的衰竭，豐富的海洋微藻資源成了人們研究的熱點(diǎn)。海洋微藻含有高價(jià)值的營養(yǎng)成分及藥物活性成分，如蛋白質(zhì)、色素、脂肪類、維生素等生物活性物質(zhì)[1-3]，是具有巨大應(yīng)用價(jià)值的潛在資源；但由于藻種保存技術(shù)的限制，已成為海洋微藻資源商業(yè)化培養(yǎng)開發(fā)的瓶頸。分離純化得到1個(gè)單藻種，往往需花費(fèi)數(shù)月時(shí)間甚至更長，尤其篩選出1個(gè)優(yōu)良的、有應(yīng)用價(jià)值的微藻藻種就更加困難，因此成功的保種方法是微藻培養(yǎng)和進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前海洋微藻在科研和實(shí)踐生產(chǎn)中常采用的保種方法有繼代培養(yǎng)法、固定化保存、超低溫保存法。這些方法在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多弊端，如繼代培養(yǎng)在長時(shí)間培養(yǎng)、多次接種下，易導(dǎo)致藻種污染或者遺傳漂變，生命力減退等失去良種的價(jià)值。固定化培養(yǎng)程序較復(fù)雜，需要細(xì)心操作，而且大多數(shù)微藻在培養(yǎng)后期常會(huì)從膠珠中溢出，有的膠珠還會(huì)融解，導(dǎo)致保種失敗。雖然大量試驗(yàn)結(jié)果表明，超低溫凍存法將存活率提高到30%以上，但同樣存在一些缺陷，需要復(fù)雜的預(yù)冷凍程序，費(fèi)用較高，耗時(shí)長且不可避免凍融過程中晶體的形成，對(duì)保存材料造成損傷。因此研究者在超低溫貯存技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了新的探索，發(fā)展起來包埋-脫水法和玻璃化法2種新的冷凍保存技術(shù)。包埋-脫水法操作簡單，但存活率較低，僅為15%[4]，而玻璃化凍存法不僅可以克服前幾種保存技術(shù)中費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、易污染等弊病，而且超低溫還可能殺滅有害致病菌，達(dá)到實(shí)現(xiàn)種質(zhì)長期保存的目的[5]。經(jīng)過玻璃化凍存的藻種相當(dāng)于進(jìn)行了一次優(yōu)勝劣汰的復(fù)壯作用，復(fù)蘇后存活下來的藻細(xì)胞一般會(huì)比未凍存的長得更好、更高產(chǎn)和抗凍性更強(qiáng)[6]。因此將玻璃化法用于海洋微藻種質(zhì)的凍存將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

1海洋微藻的玻璃化凍存技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

自1985年Rall等[7]首次應(yīng)用玻璃化冷凍技術(shù)成功保存小鼠胚胎至今，已成功凍存了小鼠、兔、牛、豬、山羊等多種哺乳動(dòng)物胚胎。目前玻璃化凍存技術(shù)的研究和應(yīng)用多見于動(dòng)物胚胎和高等植物種質(zhì)的保存[8-10]，對(duì)于藻類的研究較少，但已有成功報(bào)道。如項(xiàng)黎新等[11]對(duì)衣藻細(xì)胞玻璃化凍存，獲得31.45%的存活率，恢復(fù)培養(yǎng)后其生長規(guī)律和未凍存的衣藻一致；Day采用該法保存小球藻配子體時(shí)，存活率高達(dá)100%[12]。劉麗娜等[13]也采用了此方法對(duì)湛江等地鞭金藻進(jìn)行保存，存活率高達(dá)54%。這表明玻璃化法在藻類種質(zhì)的超低溫保存中具有較大的應(yīng)用潛力。

“玻璃化”是一個(gè)物理學(xué)上的概念，指當(dāng)水或溶液快速降溫達(dá)到或低于-100～-110 ℃的溫度范圍時(shí)，形成一種具有高粘度的介于液態(tài)和固態(tài)之間非晶體態(tài)、雜亂無章、透明的玻璃狀態(tài)[14]。其物理性能與晶體態(tài)不同，是一種可以減輕或避免冷凍細(xì)胞及組織的損傷，達(dá)到長期保存的良好方法。玻璃化冷凍技術(shù)與常規(guī)的保存方法（如繼代培養(yǎng)，低溫凍存）相比，具有以下優(yōu)勢[15]：（1）簡化了冷凍操作步驟，無需貴重的程序降溫儀，整個(gè)操作就短短幾分鐘。（2）能夠有效避免胞內(nèi)冰晶的形成，從而降低細(xì)胞因形成冰晶而導(dǎo)致各種物理及化學(xué)的損傷。（3）玻璃化凍存有效抑制細(xì)胞的代謝活動(dòng)，長期保持生物遺傳穩(wěn)定性。玻璃化凍存簡單、高效的特點(diǎn)，近年來備受關(guān)注，是今后微藻冷凍保存技術(shù)的發(fā)展方向。不過玻璃化冷凍保存對(duì)保護(hù)劑組合、濃度及降溫升溫速率有特殊的要求。保護(hù)劑組合的總濃度一般要高達(dá)5.0～7.0 mol/L 才能實(shí)現(xiàn)玻璃化凍存，而高濃度的保護(hù)劑對(duì)保存材料產(chǎn)生嚴(yán)重毒性，因此在保存細(xì)胞或組織時(shí)，減少保護(hù)劑的毒性至關(guān)重要。

2海洋微藻玻璃化凍存的程序及研究進(jìn)展

海洋微藻自身是否有抗凍性對(duì)存活率產(chǎn)生重大的影響，對(duì)于冷敏感的微藻應(yīng)選用繼代培養(yǎng)保存法。因?yàn)樵孱惣?xì)胞含水量及液泡化程度高，在液氮保存中，0 ℃以下至低共熔點(diǎn)的溫度范圍內(nèi)，都處于危險(xiǎn)狀態(tài)，因此冷敏感的藻種不利于低溫貯存。同時(shí)對(duì)于具有抗凍性的藻種在低溫貯存中，從冷凍保護(hù)劑預(yù)處理、常溫到低溫、低溫儲(chǔ)存以及從低溫恢復(fù)到常溫和保護(hù)劑的去除等都至關(guān)重要，稍有操作失誤都會(huì)使細(xì)胞致死。因此根據(jù)藻種的差異性選擇合適的保存方法，對(duì)于超低溫凍存的藻種，應(yīng)盡可能選擇毒性小，抗凍效果好的保護(hù)劑及優(yōu)化凍存程序。液氮貯存相對(duì)其他貯存方法，是長久保持種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性較有效的方法，且凍存技術(shù)相對(duì)成熟。

2.1海洋微藻材料的選擇

1976年，Morris就對(duì)多種不同的種、株小球藻進(jìn)行冷凍試驗(yàn)，結(jié)果表明抗凍性存在極大差異。低溫凍存的存活率跟藻種細(xì)胞的生長時(shí)期有關(guān)，有研究報(bào)道有些藻種處于靜止期時(shí)細(xì)胞抗凍性較好，存活率高于指數(shù)期細(xì)胞。如王起華等[16]對(duì)牟氏角刺藻和新月菱形藻進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明靜止期細(xì)胞的存活率顯著高于指數(shù)期。但也有研究報(bào)道某些藻種的指數(shù)生長期的抗凍性高于靜止期[17]。然而Ben-Amotz等[18]對(duì)12種海藻的冷凍保存研究發(fā)現(xiàn)抗凍性與藻細(xì)胞的生長時(shí)期無關(guān)。對(duì)此尚未見到有關(guān)細(xì)胞生長時(shí)期對(duì)凍存存活率影響的深入研究，因此不同生長時(shí)期細(xì)胞的抗凍性可能與藻種有關(guān)，對(duì)于不同的藻種應(yīng)選用抗凍性較好的那個(gè)生長階段的細(xì)胞進(jìn)行凍存。

2.2冷凍保存前的預(yù)培養(yǎng)及低溫馴化

2.2.1預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)是對(duì)培養(yǎng)條件做適宜的改變，以提高藻類的抗凍性。如對(duì)某些營養(yǎng)鹽進(jìn)行限制，營養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件（光照，溫度）的改變誘導(dǎo)出較大的抗凍性。Mortaint-Bertrand[19]等通過限制培養(yǎng)基中碳酸氫鈉和磷酸鹽的含量，明顯提高了杜氏鹽藻冰凍保存的存活率。項(xiàng)黎新等[11]取對(duì)數(shù)生長期的衣藻細(xì)胞離心濃縮，于不同的蔗糖濃度中光照預(yù)培養(yǎng)2 d再進(jìn)行玻璃化凍存，存活率達(dá)31.45%，且恢復(fù)培養(yǎng)后生長規(guī)律與未凍存的一致。

2.2.2低溫馴化 低溫馴化是一種常用的預(yù)處理方式，通過低溫馴化，細(xì)胞會(huì)發(fā)生保護(hù)性脫水，避免引起細(xì)胞內(nèi)大量結(jié)冰從而引起細(xì)胞死亡，這對(duì)低溫敏感藻種的玻璃化凍存極其重要[20]。Halmaggi等[21]在待凍存的藻液中加入一定濃度的葡萄糖或蔗糖，于4～15 ℃黑暗下馴化16～72 h，研究發(fā)現(xiàn)抗凍性明顯提高。王起華等將牟氏角剌藻和新月菱形藻進(jìn)行低溫黑暗馴化再凍存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藻種的抗寒性明顯提高，存活率提高10%左右[16]。

2.3玻璃化抗凍劑組合的篩選

抗凍保護(hù)劑具有較強(qiáng)的親水性，在水結(jié)冰過程中干擾水分子的晶格排列，抑制冰晶的形成，在一定程度上對(duì)凍存材料起保護(hù)作用。保護(hù)劑有滲透性和非滲透性兩大類，滲透性保護(hù)劑主要有甘油、二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇等，可迅速滲入細(xì)胞內(nèi)，使胞內(nèi)溶質(zhì)增加，降低細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，同時(shí)充分脫水，避免凍存時(shí)冰晶形成造成傷害。但是滲透性保護(hù)劑具有一定毒性，因此保存材料在玻璃化液中暴露的時(shí)間盡可能短，溫度盡量低。非滲透性保護(hù)劑一般情況下不能自由擴(kuò)散透過細(xì)胞膜，主要有葡萄糖、蔗糖和海藻糖等低分子糖類。非滲透性保護(hù)劑可為細(xì)胞提供一個(gè)高滲環(huán)境限制水分過快進(jìn)入細(xì)胞，避免解凍時(shí)發(fā)生滲透性休克，起特異性保護(hù)作用。

在冷凍過程中，常將這兩類保護(hù)劑聯(lián)合使用，因?yàn)橛行┍Ｗo(hù)劑如甘油，乙二醇等，滲透作用強(qiáng)、化學(xué)毒性小，但玻璃化能力稍差，而有些保護(hù)劑如二甲基亞砜，玻璃化狀態(tài)效果好，但滲透性較差，毒性大。并且要形成較好的玻璃化狀態(tài)，保護(hù)劑組合的濃度需高達(dá)5～7 mol/L，因此將這些保護(hù)劑配合使用后能功能互補(bǔ)，既保證了抗凍劑的滲透性，較好的玻璃化能力又降低了使用單一保護(hù)劑高濃度的毒性。

2.4冰凍保存的操作程序

2.4.1凍存時(shí)藻細(xì)胞的預(yù)處理在藻細(xì)胞凍存前，需先對(duì)保護(hù)劑的濃度及預(yù)平衡時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，確定較適合的保護(hù)劑濃度及預(yù)處理時(shí)間，因?yàn)楦邼舛鹊谋Ｗo(hù)劑對(duì)細(xì)胞有毒害性，毒性大小與使用濃度及處理時(shí)間相關(guān)[22]。確定保護(hù)劑濃度后，將保護(hù)劑組合配制成使用體積分?jǐn)?shù)的2倍，先用稀釋到使用時(shí)一半濃度的玻璃化溶液對(duì)藻細(xì)胞預(yù)平衡。預(yù)平衡時(shí)間的長短因藻種而異，處理時(shí)間過短或過長都會(huì)降低存活率，一般在 0 ℃ 或25 ℃下處理5～60 min[23]，如湛江等鞭金藻預(yù)處理 50 min[24]，小新月菱形藻預(yù)處理60 min[25]。采用逐步加入法，使細(xì)胞適度脫水，然后去除預(yù)平衡溶液，加入玻璃化溶液，迅速投入液氮中進(jìn)行保存，整個(gè)操作盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成，避免細(xì)胞在保護(hù)劑中暴露時(shí)間過長受到毒副作用。

2.4.2藻細(xì)胞的解凍操作凍存材料的復(fù)蘇一般采用快速解凍法，將凍存材料迅速轉(zhuǎn)移到40 ℃水浴中，快速振蕩直至最后1粒冰晶消失。然后在冰浴中或室溫下加入培養(yǎng)液稀釋，離心去除保護(hù)劑，再用培養(yǎng)基漂洗解凍材料2～3遍，洗滌時(shí)間根據(jù)藻細(xì)胞的耐滲透壓選擇[26]。解凍洗滌以快速除去高濃度的玻璃化保護(hù)劑，避免保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞造成傷害。值得注意的是對(duì)于細(xì)胞表面有角毛或鞭毛的藻種，不適合采用離心法去除保護(hù)劑，直接用稀釋法，因?yàn)樵陔x心過程中易造成機(jī)械傷害而影響存活率[16]。

2.4.3解凍后的恢復(fù)培養(yǎng)化凍后的材料需在特定培養(yǎng)條件下才能更好地快速恢復(fù)生長，再培養(yǎng)條件如光照、溫度、營養(yǎng)液溶度等對(duì)存活率均有較大影響[27]。有結(jié)果表明經(jīng)玻璃化凍存后的材料先暗培養(yǎng)1 d再過渡到光照中培養(yǎng)，存活率均高于直接光照培養(yǎng)，且能較快恢復(fù)正常生長。至于化凍后先經(jīng)暗培養(yǎng)再光照培養(yǎng)可提高存活率的機(jī)理尚需進(jìn)一步深入研究。

2.5存活率的測定

目前不同測定方法的可靠性差異很大，因此對(duì)細(xì)胞存活率的準(zhǔn)確估計(jì)存在較大誤差，也是影響存活率的一個(gè)因素。近幾年應(yīng)用較多的存活率測定法是分光光度法及溶液培養(yǎng)-細(xì)胞計(jì)數(shù)法。其中分光光度法是將恢復(fù)生長后的藻液，于分光光度計(jì)一定波長下測得吸光度，根據(jù)預(yù)先確定好的藻細(xì)胞密度（y）與吸光度（x）的直線回歸方程推算出冷凍后的細(xì)胞密度，然后與對(duì)照組進(jìn)行比較，得出比值即為存活率[28-29]。溶液培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法，是將復(fù)蘇后恢復(fù)生長到一定天數(shù)（n）的藻液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞密度，根據(jù)回歸方程Y=aXb（Y為培養(yǎng)n d后的藻細(xì)胞密度，X為藻細(xì)胞的初始密度，此方程由不同初始密度的藻液與培養(yǎng)n d后測得的藻細(xì)胞密度擬合所得）計(jì)算出活細(xì)胞密度，與對(duì)照組對(duì)比獲得存活率[30-31]。

除此之外，細(xì)胞存活率的測定法還有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力測定法、光合放氧活性測定法及葉綠素含量測定法等。不同測定方法的可靠性差異極大，因此對(duì)于保存方法優(yōu)劣的評(píng)估較為困難。

3海洋微藻玻璃化凍存苗的應(yīng)用前景

隨著微藻種質(zhì)玻璃化保存技術(shù)不斷深入研究和完善，使得海洋微藻在開發(fā)和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮越來越大的作用。如建立微藻玻璃化保存種質(zhì)庫，保持一些稀有的及瀕危微藻的種質(zhì)資源，便于國內(nèi)外學(xué)術(shù)交流中微藻種質(zhì)的交換。同時(shí)通過玻璃化凍存有可能培養(yǎng)出抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良微藻新品系，為低溫生物學(xué)領(lǐng)域提供新的資料。過去海洋微藻的商業(yè)化開發(fā)主要用作海產(chǎn)養(yǎng)殖的食物餌料，而隨著研究工作的深入，通過微藻種質(zhì)的保存、選育，養(yǎng)殖方式的選擇及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，可獲得人們期望的大量代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)在海洋微藻的養(yǎng)殖及產(chǎn)品開發(fā)已經(jīng)成為新興生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)[32-33]，在食品、醫(yī)藥、化妝品、生物新能源、環(huán)境污水及廢氣的處理中顯現(xiàn)出廣闊的前景。

3.1作為營養(yǎng)保健品廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域

海洋微藻富含蛋白質(zhì)、色素、多糖及PUFAs，在醫(yī)藥和保健品的開發(fā)應(yīng)用方面具有巨大的潛力[34]。據(jù)報(bào)道小球藻的蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，是大豆的2倍、雞蛋的6倍、大米的10倍，而且微藻中還含有高含量的礦物質(zhì)元素、人體必需氨基酸及維生素等，其中鐵質(zhì)含量和維生素A分別是葡萄干的50倍、4倍，豬肝的16倍；鈣含量是牛奶的2倍；同時(shí)還含有比鵝肝更高的維生素B12[35]。目前許多國家把可食用微藻與其他保健品原料混合加工成保健食品（粉劑、片劑、膠囊劑），如餅干、營養(yǎng)塊和飲料等，已上市的保健食品有賜拜年小球藻粉、施普瑞螺旋藻膠囊、新大澤螺旋藻營養(yǎng)早餐、綠A天元甘露等產(chǎn)品（中國植物微藻DHA行業(yè)市場調(diào)查報(bào)告2013版）。美國夏威夷納斯達(dá)克上市公司從雨生紅球藻中提取蝦青素，生產(chǎn)出了BioA-stin天然蝦青素膠囊，并通過美國FDA認(rèn)證，達(dá)到GMP標(biāo)準(zhǔn)，其抗氧化能力是維生素E的550倍，是β-胡蘿卜素的10倍[36]。此活性物質(zhì)加入化妝品具有增加皮膚彈性，潤膚保濕，祛斑除皺紋的功效，法國最早將螺旋藻加入化妝品（如面膜、護(hù)發(fā)品、護(hù)膚霜等），備受消費(fèi)者的青睞。

同時(shí)PUFAs在營養(yǎng)學(xué)與醫(yī)學(xué)上具有不可比擬的作用，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。尤其是EPA和DHA，具有維護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，防治心血管疾病、動(dòng)脈硬化、糖尿病、肥胖等人類疾病，提高人類記憶力。Angerer等[37]研究發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈病變的程度和脂肪組織中DHA濃度呈負(fù)相關(guān)，每天讓冠心病患者攝入一定量的w-3型多不飽和脂肪酸，可減緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病變速度。Robert等研究結(jié)果表明DHA對(duì)嬰兒大腦、眼的機(jī)能發(fā)育及視網(wǎng)膜組成，視力保護(hù)，提高記憶力和促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要的作用[38-39]。藻類培養(yǎng)不受季節(jié)和氣候限制，可全年進(jìn)行生產(chǎn)，且從海洋微藻中提取的脂肪酸組成簡單無魚腥味，提取工藝較為簡單。美國Martek公司已篩選得到高產(chǎn)EPA和DHA的藻種，其EPA和DHA的最終產(chǎn)量分別為 0.25、1.2 g/（L·d）。2013年5月15日，我國召開的第十一次全國營養(yǎng)科學(xué)大會(huì)，將DHA+EPA的推薦攝入量明確寫入DRIs（中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量）。目前，我國有不少生產(chǎn)嬰幼兒食品的廠家通過添加微藻油來提高產(chǎn)品中DHA的含量，如亨氏、貝因美、伊利、光明乳業(yè)、圣元等[40]。因此，海洋微藻油脂作為營養(yǎng)保健品的理想原料，目前在國內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)入應(yīng)用階段。

3.2用于水環(huán)境污染修復(fù)

近年來隨著工業(yè)的進(jìn)步和人們生活水平的提高，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，如廢氣過量排放，水資源的富營養(yǎng)化及重金屬污染等?，F(xiàn)階段污水處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。與傳統(tǒng)方法相比，利用生物法處理適用范圍廣、成本低、而且可以避免二次污染。尤其近幾年發(fā)展起來的藻類修復(fù)水環(huán)境污染的能力具有不可比擬的優(yōu)勢，海洋微藻資源豐富、廉價(jià)易得、生長速度快 適應(yīng)性強(qiáng)、吸附量大，不僅可以高效去除污水中的有機(jī)、無機(jī)以及重金屬等污染物，還可將培養(yǎng)微藻的污水處理同微藻餌料、生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)耦合，產(chǎn)生一定的附加值[41]。因此利用藻類進(jìn)行污水處理和水環(huán)境修復(fù)具有可行性。

許丹妮[42]初步研究了固定化小球藻對(duì)市政污水的凈化，結(jié)果表明，在人工污水pH值為7.2，水溫20 ℃的條件下對(duì)污水中的氨態(tài)氮凈化效率為65.05%；對(duì)PO43-的凈化效率達(dá)7817%。張靜霞[43]將小球藻于無氮磷的培養(yǎng)基中饑餓處理 24 h，后置于人工污水中培養(yǎng)72 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)氮磷的去除率分別高達(dá)97%、99%。有研究發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻和小球藻在凈化重金屬污水中具有明顯的優(yōu)勢[44-45]，對(duì)Hg2+的吸附率可達(dá)到53. 8%。Chung 等用螺旋藻對(duì)沼氣發(fā)酵的豬糞廢水進(jìn)行二次處理，結(jié)果表明，氮的同化效率高達(dá)76%，且通過小鼠試驗(yàn)無毒性反應(yīng)[46]。張聰利用城市污水剩余污泥的抽提液培養(yǎng)小球藻和螺旋藻，發(fā)現(xiàn)污泥抽提液可部分取代傳統(tǒng)微藻培養(yǎng)的營養(yǎng)液，為藻蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供廉價(jià)的原料[47]。

Liu等認(rèn)為大部分廢水特別是食品工業(yè)的廢水（如糖蜜、乳制品的廢水）都可用來培養(yǎng)某些藻種，將獲得的微藻用作飼料或肥料，達(dá)到消除污染和再生能源雙贏的效果[48]。這種低成本、低耗能、效益明顯的廢水凈化方式，有著巨大的開發(fā)潛力。

3.3作為可再生能源

石油和煤炭等能源儲(chǔ)量的日益減少，且該能源在燃燒過程中會(huì)對(duì)空氣造成污染，使得不斷增長的需求與日益嚴(yán)重的環(huán)境污染之間形成尖銳的矛盾，因此尋找新的清潔的替代能源，已成為倍受人們關(guān)注的課題。微藻油脂含量高，利用光照產(chǎn)油的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了最好的油料作物，產(chǎn)生物柴油的量是最好油料作物的8～24倍[49-50]。并且海洋微藻的養(yǎng)殖在天然的海域即可，不與農(nóng)業(yè)爭地。因此海洋微藻作為一種重要的可再生能源物質(zhì)，無論從能源供給的角度還是從環(huán)境保護(hù)的角度來講，都具有科學(xué)意義。

研究發(fā)現(xiàn)海洋微藻的生長速度非常快，在指數(shù)生長期，生物量倍增時(shí)間可短至3.5 h，油脂含量占細(xì)胞干質(zhì)量的80%[51]。何峰等研究了不同碳源及生長條件對(duì)三角褐指藻總脂含量積累的影響，結(jié)果表明在葡萄糖濃度為20 mmol/L、溫度（25±1） ℃、光強(qiáng)25 μmol/（m2·s）、pH值7.5的條件下，總脂含量達(dá)到 20%（細(xì)胞干質(zhì)量），證實(shí)了該藻種可用于提取生物柴油[52]。賀立靜對(duì)微藻產(chǎn)氫進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明緣微囊藻、假魚腥藻、束絲藻、絲藻、萊茵衣菜、顫藻和銅綠微囊藻在TAP和TAP-S培養(yǎng)液中均能產(chǎn)氫，其中萊茵衣藻在TAP-S培養(yǎng)液中產(chǎn)氫最多，培養(yǎng)120 h總產(chǎn)氫量達(dá)到 4.77 mL，產(chǎn)氫速率0.63 mL/（h·L）[53]。1998年美國再生能源國家實(shí)驗(yàn)室通過現(xiàn)代生物技術(shù)，將來自小環(huán)藻的乙酞輔酶A梭化酶基因?qū)胄…h(huán)藻得到1株工程小環(huán)藻，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下該藻的總脂肪酸含量高達(dá)60%以上，戶外生產(chǎn)也可達(dá)到40%以上[54]。近年來采用基因工程技術(shù)構(gòu)造“工程微藻”的報(bào)道層出不窮[55-57]。2010年，中國科學(xué)院青島生物能源研究所與美國波音公司共同簽署了推進(jìn)藻類航空可持續(xù)生物燃料合作備忘錄，啟動(dòng)微藻航空生物柴油能源技術(shù)的大規(guī)模開發(fā)。微藻與陸生作物相比，具有生物量大、生長周期短、脂質(zhì)含量高等特點(diǎn)，已成為生物燃油原料的首選。因此大力發(fā)展微藻類生物柴油，對(duì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，推進(jìn)能源替代，舒緩環(huán)境壓力，控制大氣污染具有重要的戰(zhàn)略意義。

4展望

玻璃化凍存法綜合了傳統(tǒng)方法與超低溫保存技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，克服不足，使之在海洋微藻種質(zhì)資源保存中獨(dú)具潛力與優(yōu)勢。因此，采用玻璃化法建立海洋微藻的超低溫種質(zhì)資源庫已成為該領(lǐng)域今后發(fā)展的一個(gè)趨勢。玻璃化法超低溫保存研究雖然取得了一些令人鼓舞的進(jìn)展，但是針對(duì)這一新興領(lǐng)域，還有許多問題需要做進(jìn)一步的探討與研究。如對(duì)于不同的藻種，未建立起與之相適應(yīng)的完善的保存體系。在整個(gè)方法體系中，針對(duì)不同材料的特性，選擇與之相適應(yīng)的冷凍保護(hù)劑組合及其濃度成為該技術(shù)的難點(diǎn)和重點(diǎn)；對(duì)于已保存的材料，在整個(gè)超低溫保存過程中所發(fā)生的生理生化反應(yīng)并不能完全描述清楚，如細(xì)胞的抗凍機(jī)理仍不明確，所以需對(duì)玻璃化法保存微藻的生化機(jī)理進(jìn)行深入研究。

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