嗜酸氧化亞鐵硫桿菌細(xì)胞色素C家族afe_0378基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異及生物信息學(xué)挖掘

劉元東， 郭淑慧， 余潤蘭

(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院 生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410083)

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌細(xì)胞色素C家族afe_0378基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異及生物信息學(xué)挖掘

劉元東， 郭淑慧， 余潤蘭*

(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院 生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410083)

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌是一種極為重要的浸礦微生物，具有氧化各種還原性含硫物及亞鐵等功能。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及生物信息學(xué)等手段對該菌一個(gè)涉及鐵硫氧化由afe_0378基因編碼的細(xì)胞色素C家族蛋白CycA2進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，afe_0378基因在單質(zhì)硫培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄水平是亞鐵培養(yǎng)條件下的2.67倍。生物信息學(xué)分析表明afe_0378編碼蛋白CycA2是分子質(zhì)量為22.959 ku，pI為9.75的結(jié)合內(nèi)膜的周質(zhì)蛋白，二級結(jié)構(gòu)為全α-螺旋，無β-折疊，包含2個(gè)相似結(jié)構(gòu)域及N端一段跨膜疏水螺旋，屬于細(xì)胞色素C4型蛋白家族。CycA2蛋白分子三維結(jié)構(gòu)模建表明，雙血紅素與CycA2蛋白序列片段域C48-X-X-C51-H52及C149-X-X-C152-H153中的半胱氨酸共價(jià)連接。結(jié)合該菌硫代謝背景知識，推測CycA2蛋白的功能是介導(dǎo)細(xì)胞色素bc1復(fù)合體及終端氧化酶細(xì)胞色素aa3復(fù)合體之間的電子傳遞而參與硫代謝。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌；細(xì)胞色素C4型蛋白；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；生物信息學(xué)

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans，簡稱A.f)是生物浸礦應(yīng)用中最為著名和非常重要的微生物之一[1-2]，屬革蘭陰性化能自養(yǎng)嗜酸菌，好氧兼無氧呼吸，能量代謝途徑復(fù)雜、靈活多樣，尤其是對各種還原性含硫物及亞鐵的能量代謝，是浸礦功能的關(guān)鍵[2]，因而其鐵硫代謝機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。目前，鐵代謝機(jī)制已基本闡明。關(guān)于硫代謝機(jī)制模型雖有提出，但因硫化物氧化過程中多價(jià)態(tài)硫的中間產(chǎn)物的生成及化學(xué)氧化協(xié)同作用的復(fù)雜性，這些模型都未得到直接的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[1,3-4]。細(xì)胞色素C4型蛋白是一類通過高度保守序列(CXXCH)共價(jià)結(jié)合2個(gè)血紅素輔基為特征的蛋白家族，其功能通常是作為電子傳遞載體參與多種生物的氧化還原反應(yīng)，如有氧呼吸等[5]。A.f菌是至今唯一發(fā)現(xiàn)基因組內(nèi)含有4種C4型細(xì)胞色素蛋白同源基因的生物，且其C4色素蛋白有著高氧化還原電勢、良好的耐酸性及高等電點(diǎn)等鮮明特征，是涉及鐵硫氧化的重要候選者[6]。本研究中由afe_0378基因編碼的CycA2蛋白即屬其中之一。它位于petⅡ操縱子，該操縱子被認(rèn)為參與以硫/甲酸為供體，O2/Fe3+為終端受體的電子傳遞過程[1]。但目前關(guān)于CycA2蛋白的功能并無定論。為徹底闡明該菌硫氧化代謝機(jī)制，彌補(bǔ)以往代謝模型中可能缺失的代謝步驟，展開預(yù)測或?qū)ふ倚碌拿讣半娮觽鬟f組分的研究具有重要意義。本文從分子轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步了解afe_0378基因mRNA表達(dá)規(guī)律，并利用生物信息學(xué)手段探索CycA2蛋白的結(jié)構(gòu)及其在該菌硫代謝中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株 原始菌株A.f菌ATCC 23270購自美國ATCC。

1.1.2 試劑及儀器Taq酶(R001A,TaKaRa)、DNA分子Maker(MD 109,天根生化)；TRIzol(15596-026,Invirtrogen)；DNase I(2212,TaKaRa)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A,TaKaRa)；RNeasy Mini Kit(74104, Qiagen); SYBR qPCR Mix (204054，Qiagen)；Gel extraction kit(D6492-01，Omega)。PCR熱循環(huán)儀(Bio-rad S1000TMThermal cycler)及實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-rad icycler)凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc,Bio-rad); NanoDrop?1000微量分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)。

1.2方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 引物設(shè)計(jì)參考目的基因afe_0378(GenBank ID: 7134782)及內(nèi)參基因rrs(GenBank ID:7136017)的基因序列，Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。引物對(5′-3′)：rrs-F (ACACTGGGACTGAGACACGG)，rrs-R (ACCGCCTACGCACCCTTTAC),擴(kuò)增片段長277 bp;afe_0378-F (AAAGCTGTACTTCGGTGGTCTGC)，afe_0378-R (CCAGTGCCGTGATTTGTTTCG)，擴(kuò)增片段長230 bp。兩目的片段共用同一PCR擴(kuò)增參數(shù)，參數(shù)如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。目的擴(kuò)增片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收后測序(上海生工生物工程有限公司)，BLAST比對分析引物特異性，并做融解曲線分析。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 菌體在每升9 K基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入44.7 g FeSO4或10 g單質(zhì)S，于180 r/min, 30 ℃空氣振蕩培養(yǎng)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制菌體生長曲線。菌體生長進(jìn)入對數(shù)期中期(Fe2+/44 h，S/107 h)時(shí)，濾紙過濾培養(yǎng)液中的黃鉀鐵礬或單質(zhì)硫等雜質(zhì)，于10 000 r/min，4 ℃離心20 min ，棄去上清，收集菌體沉淀。按照經(jīng)典TRIzol法提取菌體RNA，得到的RNA經(jīng)Qiagen公司的RNeasy mini kit 純化及DNase I處理，以rrs引物對PCR驗(yàn)證基因組是否除去。純化后的RNA質(zhì)量通過1%的瓊脂糖電泳及NanoDrop?1000微量分光光度計(jì)檢測分析，再逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及數(shù)據(jù)處理 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板是RT-PCR后切膠回收純化得到的目的擴(kuò)增片段，微量分光光度計(jì)檢測濃度，根據(jù)公式：拷貝數(shù)=6.02×1023×c/(Mw×Length)(c: 核酸濃度(ng/μL), Mw：堿基對相對分子質(zhì)量(660)，Length：目的擴(kuò)增片段長度)計(jì)算拷貝數(shù); 熒光定量反應(yīng)體系：SYBR qPCR Mix (Qiagen) 10 μL，正反向引物各3 μL (終濃度為300 nmol/L)，梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品模板1 μL，無RNase ddH2O補(bǔ)至20 μL；熒光定量PCR條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)樣品平行3份，重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)。按照雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：Fold= (待測組樣品目的基因拷貝數(shù)/待測組樣品內(nèi)參基因拷貝數(shù)) / (對照組樣品目的基因拷貝數(shù)/對照組樣品看家基因拷貝數(shù))計(jì)算afe_0378基因在Fe2+及S0培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異。

1.2.4 生物信息學(xué)分析afe_0378基因編碼氨基酸的一級序列通過ProdictProtein在線軟件(https://www.predictprotein.org/)進(jìn)行蛋白的理化性質(zhì)分析；利用signalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽；利用在線分析軟件InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)預(yù)測蛋白的分類及結(jié)構(gòu)域；I-TASSER(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) 預(yù)測二級結(jié)構(gòu)；以結(jié)晶結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析的A.ferrooxidansCyc1(PDB ID：1H1O)蛋白[7]為模板，利用SIWSS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)自動(dòng)模式(automated model)在線同源建模。

2 結(jié)果與分析

2.1亞鐵和硫能源培養(yǎng)下基因afe_0378轉(zhuǎn)錄差異

提到的總RNA經(jīng)電泳檢測，23S/16S rRNA條帶亮度比值在1.8～2.2范圍內(nèi)，OD260/OD280=1.90～2.10范圍內(nèi)。PCR驗(yàn)證，電泳表明無條帶出現(xiàn)(未給出圖片)，說明總RNA無基因組污染。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA經(jīng)NanoDrop?1000微量分光光度計(jì)檢測，在260 nm處有最大吸收峰，其中OD260/OD280在1.75～1.85范圍內(nèi)，表明總RNA、cDNA質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收后，再次2 %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明擴(kuò)增片段長度與期望相符；RT-PCR融解曲線表明未形成引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，說明設(shè)計(jì)引物質(zhì)量實(shí)驗(yàn)可用(圖1)。

目的基因afe_0378及內(nèi)參基因rrs的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均≥0.98，擴(kuò)增效率在100%～106%范圍內(nèi)(圖2)，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可用于樣品定量分析。RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，以單質(zhì)硫?yàn)槟茉吹孜锏呐囵B(yǎng)條件下，afe_0378基因的數(shù)據(jù)為6.75E+05±3.69E+04，rrs基因的數(shù)據(jù)為9.63E+07±5.07E+06；以亞鐵為能源底物的培養(yǎng)條件下，afe_0378基因的數(shù)據(jù)為5.01E+05±6.08E+04，rrs基因的數(shù)據(jù)為1.91E+08±1.31E+07；由雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析可得,afe_0378基因在以單質(zhì)硫?yàn)槟茉吹孜锏呐囵B(yǎng)條件下較以亞鐵為能源物質(zhì)條件下表達(dá)量上調(diào)2.67倍，與文獻(xiàn)報(bào)道的A.f菌硫代謝關(guān)鍵酶硫化物泛醌氧還酶的sqr基因[3]及內(nèi)膜單核細(xì)胞色素C蛋白的afe_1130基因情況一致[4]。

圖1 引物特異性驗(yàn)證Fig.1 Verification of primer pairs’specificity

A:目的片段切膠純化回收后電泳圖；M：DNA Marker(100 bp DNA Ladder,天根)；1:rrs基因目的擴(kuò)增片段；2:afe_0378基因目的擴(kuò)增片段；B:rrs基因融解曲線；C：afe_0378融解曲線分析

A: Electrophoresis of purified PCR product; M: DNA Marker(100 bp DNA Ladder,tiangen)；1: The purified PCR product ofrrsgene；2：The purified PCR prdouct ofafe_0378 gene；B: The melt curve ofrrsgene；C: The melt curve ofafe_0378 gene

2.2基因afe_0378生物信息學(xué)分析

理化性質(zhì)預(yù)測，afe_0378基因編碼一個(gè)分子質(zhì)量為22.959 ku，pI為9.75的親水周質(zhì)蛋白，該蛋白不穩(wěn)定，但熱穩(wěn)定性強(qiáng)，在原核生物胞內(nèi)半衰期超過10 h以上。信號肽預(yù)測分析在N端有一段長30個(gè)氨基酸的信號肽?？缒ゎA(yù)測在N端有一段疏水跨膜螺旋氨基酸序列，且定位在細(xì)胞周質(zhì)中，因此CycA2可能通過一段疏水跨膜螺旋錨定在細(xì)胞內(nèi)膜上并面向細(xì)胞周質(zhì)側(cè)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測表明，α-螺旋占54.38%，無規(guī)卷曲占45.62%，沒有β-折疊，這說明該蛋白屬于α-螺旋類型。多序列比對分析顯示CycA2蛋白有2個(gè)特征血紅素結(jié)合片段域CXXCH(圖3)。結(jié)構(gòu)域分析表明該蛋白有2個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域，對應(yīng)氨基酸序列分別是34～118位、125～217位，分別結(jié)合2個(gè)血紅素輔基，屬于典型細(xì)胞色素C4蛋白家族，該家族蛋白主要在微生物的呼吸鏈中作為中間電子傳遞載體[5]。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線圖Fig.2 Standard curve and PCR quantification curve of real-time PCR

圖3 多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment (the conserved characteristic sequences are framed)

圖4 CycA2的建模結(jié)構(gòu)

2.4CycA2蛋白功能探討

A.f菌有2套bc1復(fù)合體[1,3]，其中1套稱為正向bc1復(fù)合體，它發(fā)揮“正?！钡纳砉δ?，即將來自氫醌的電子傳遞給小分子氧還蛋白，然后再傳給終端氧化酶細(xì)胞色素aa3復(fù)合體，它的3個(gè)亞基由petⅡ操縱子上的petABC2編碼，已被推測參與硫代謝；另1套稱為反向bc1復(fù)合體，即將來自小分子氧還蛋白的電子反向傳遞給氫醌，它的3個(gè)亞基由petⅠ操縱子上的petABC1編碼，已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)參與亞鐵代謝?；騛fe_0378正好位于petⅡ操縱子內(nèi)。同一操縱子編碼的蛋白可能相互作用完成同一功能代謝，因此推測CycA2是在硫代謝中發(fā)揮功能。本研究的生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，CycA2具有典型微生物電子傳遞細(xì)胞色素C4蛋白家族的特征，其蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征與A.f菌中已經(jīng)得到表征的正向電子傳遞鏈中細(xì)胞色素C蛋白相符，因此硫代謝中接收來自氫醌的小分子氧還蛋白就是CycA2。本研究的qRT- PCR實(shí)驗(yàn)顯示了afe_0378基因在硫代謝條件上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，這可能是因?yàn)樵谝詥钨|(zhì)硫?yàn)槲ㄒ荒茉吹呐囵B(yǎng)條件下，生物體需要大量表達(dá)相關(guān)基因來合成相應(yīng)蛋白以充分獲取能源。

3 結(jié) 論

亞鐵培養(yǎng)和單質(zhì)硫培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄差異結(jié)果表明，A.f菌的afe_0378基因在單質(zhì)硫培養(yǎng)條件下表達(dá)上調(diào)，推測CycA2參與硫代謝。生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，CycA2屬典型細(xì)胞色素C4蛋白家族蛋白，在A.f菌中對應(yīng)于硫代謝中接收來自氫醌的小分子氧還蛋白。結(jié)合該菌硫代謝背景知識，推測CycA2蛋白的功能是介導(dǎo)細(xì)胞色素bc1復(fù)合體及終端氧化酶細(xì)胞色素aa3復(fù)合體之間的電子傳遞而參與硫代謝。

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DifferentialofTranscriptionExpression&BioinformaticsTappingofaCytochromecFamilyGeneofafe_0378inAcidithiobacillusferrooxidans

LIU Yuan-dong, GUO Shu-hui, YU Run-lan

(Schl.ofMin’l.Process. &Bioengin.,KeyLab.ofBio-MetallurgyofMin.ofEduc.,Cent.S.Uni.,Changsha410083)

Acidithiobacillusferrooxidansis a very important ore-immersing microbe possessing the functions of oxidation of various reductive inorganic sulfur compounds and ferrous. In this study quantitative real-time PCR and bioinformatic means were adopted to carry out the study involving cytochrome protein family aims at the CycA2 protein involved iron and sulfur oxidation encoded by geneafe_0378. The results showed that the down transcription level under sulphur simple substance-culturing conditions ofafe_0378 gene was 2.67-fold of that under ferrous culturing conditions. Bioinformatic analyses suggested that the molecular weight ofafe_0378 gene encoded CycA2 was 22.959 ku, endomembrane combined periplasmic protein of pI at 9.75. Its secondary structure was all α-helix without β-folding, and composed of two similar domains and a N-terminal transmembrane hydrophobic helix, and belonged to C4type protein family. The established model of CycA2 protein molecular three dimensions structure suggested that di-heme was linked covalently with cysteine of C48-X-X-C51-H52 and C149-X-X-C152-H153 in CycA2 protein sequence fragments domains. Combining the background knowledge about sulfur oxidation, it was speculated that the function of CycA2 was electron communication that intermediated cytochrome bc1complex and terminal oxidase cytochrome aa3complex participating in sulfur oxidation inAcidithiobacillusferrooxidans.

Acidithiobacillusferrooxidans; cytochrome C4protein; qRT-PCR; bioinformatics

國家自然科學(xué)基金(51274268，50904080)；國家“973計(jì)劃”項(xiàng)目(2010CB630900)；中國博士后科學(xué)基金(2013M540643)

劉元東 男，副教授。研究方向?yàn)樯镆苯鸺吧镄畔W(xué)。E-mail: lydcsu@gmail.com

* 通訊作者。男，教授。研究方向?yàn)樯镫娀瘜W(xué)分析。E-mail:yrlcsu@gmail.com

2013-11-04；

2013-11-17

Q81

A

1005-7021(2014)02-0007-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.02.002