腹腔置管引流對(duì)SAP大鼠腎損傷影響的實(shí)驗(yàn)研究

周 超，鄭曉博，陳光宇，劉 彥，黎鵬武，蔣志偉，湯禮軍

腹腔置管引流對(duì)SAP大鼠腎損傷影響的實(shí)驗(yàn)研究

周 超，鄭曉博，陳光宇，劉 彥，黎鵬武，蔣志偉，湯禮軍

目的 研究腹腔置管引流對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠腎損傷的影響及作用機(jī)制。方法 將72只大鼠隨機(jī)分為3組：SAP組(A組)、SAP引流組(B組)、假手術(shù)組(C組)。每組24只，各組分6、12、24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每時(shí)間點(diǎn)分配8只。A組采用開腹后逆行胰膽管注射牛黃膽酸鈉造成SAP模型，B組在A組基礎(chǔ)上行腹腔置管引流，C組僅行開腹手術(shù)。各組分別于處理后6、12、24 h取大鼠血、腹水、胰腺及腎組織，測(cè)定血、腹水中淀粉酶和NF-κB水平；胰腺及腎組織HE染色觀察病理變化；免疫組化法測(cè)腎組織NF-κB的表達(dá)水平。結(jié)果 A組和B組較C組大鼠血及腹水淀粉酶、NF-κB顯著升高，胰腺及腎出現(xiàn)病理變化，腎組織NF-κB表達(dá)增多；B組較A組前述變化顯著減輕。結(jié)論 腹腔置管引流可以減輕大鼠SAP腎損傷。

大鼠；重癥急性胰腺炎；腹腔引流；腎損傷；NF-κB

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是常見急腹癥之一，其病情發(fā)展極快且兇險(xiǎn)，多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)和全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是其常見的并發(fā)癥。腎功能損害的發(fā)病率為14%～43%，一旦發(fā)展至急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)，其病死率可達(dá)80%[1]，SAP的嚴(yán)重程度和腎損害的程度呈正相關(guān)[2]。SAP時(shí)腹腔滲出液含有大量炎性因子、毒素、活化酶等，這些有毒物質(zhì)進(jìn)入血循環(huán)，對(duì)全身臟器有很大毒性。近年來成都軍區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心采取以腹腔置管引流為主的多種微創(chuàng)方法治療SAP取得了良好療效，避免了傳統(tǒng)開腹手術(shù)胰腺壞死組織清除及腹腔積液引流的復(fù)雜手術(shù)治療，減輕了患者痛苦[3]。但是腹腔置管引流治療改善SAP患者病情的具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察腹腔置管引流治療大鼠SAP腎損傷的變化情況，探討該方法治療SAP腎損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 選用健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠72只[購自四川省資陽市達(dá)碩動(dòng)物公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川2008-24)]，體重200～250 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w；牛黃膽酸鈉(購自Sigma公司)；血清、腹水淀粉酶試劑盒(購自泛博生物公司)；NF-κB的ELISA試劑盒(購自BD公司)；NF-κB抗體(購自博士德公司)。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 將72只大鼠隨機(jī)分為3組，每組24只，實(shí)驗(yàn)前12 h及術(shù)后禁食不禁水。(1)A組：參照Aho法[4]，腹腔注射3%戊巴比妥拉鈉0.1 ml/100 g體重麻醉，開腹后動(dòng)脈夾夾閉肝門部膽管，經(jīng)十二指腸乳頭逆行胰膽管穿刺，用輸液泵以3 ml/h的速度注射5%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g)，注射完畢后用動(dòng)脈夾夾閉近十二指腸端的胰膽管10 min。肉眼見胰腺組織充血、水腫、出血、壞死等改變后，表明制備大鼠SAP動(dòng)物模型成功，關(guān)腹對(duì)照觀察。(2)B組：按A組方法SAP模型制備成功后，在大鼠下腹部置入引流管，分層關(guān)腹后在引流管尾端接上引流袋。(3)C組：僅進(jìn)行開腹手術(shù)，翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹。所有大鼠均于術(shù)后背部皮下按40 ml/kg體重注射37 ℃生理鹽水，間隔12 h注射1次，連續(xù)注射2次。

1.3 標(biāo)本取材和處理 每組大鼠24只，再分為3組各8只，分別于相應(yīng)處理后的第6、12、24 h腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心，取上清液置于-20 ℃凍存，以待檢測(cè)；收集引流組引流袋內(nèi)腹水，3000 r/min離心10 min后于-80 ℃保存；處死大鼠后取胰腺及腎組織作病理切片，觀察病理變化。將一部分腎組織置于10%中性甲醛緩沖液中固定，一部分-80 ℃保存。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 血清和腹水淀粉酶(AMY)和NF-κB檢測(cè) 采用Beckman-Coulter Synchron LX-20全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清和腹水AMY水平；采用BIO-TEK 1510-00275C全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)血清和腹水NF-κB濃度，按NF-κB試劑盒說明書步驟操作。

1.4.2 腎組織NF-κB免疫組化染色 取腎臟10%中性福爾馬林固定，脫水、包埋，5 μm連續(xù)切片。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，胃蛋白酶消化后滴加相應(yīng)的一抗(小鼠抗大鼠NF-κB)，4 ℃冰箱過夜，滴加HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(羊抗小鼠IgG抗體)，室溫2 h，DAB顯色10 min，中性樹膠封片。NF-κB陽性細(xì)胞為胞漿與胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或深黃色顆粒。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色切片中NF-κB表達(dá)的陽性細(xì)胞灰度值進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 A組大鼠造模成功后，活動(dòng)減少，精神萎靡，食欲下降，尿量減少，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，上述癥狀逐漸加重。B組較A組大鼠活動(dòng)增加，精神可，食欲增加，尿量增多，且隨腹水不斷引流，癥狀逐漸改善。

2.2 血清及腹水淀粉酶活性 A組和B組造模后各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶活性較C組顯著升高(P<0.05)；B組與A組比較，各時(shí)間點(diǎn)血清及腹水淀粉酶活性顯著下降(P<0.05)。且隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸達(dá)到穩(wěn)態(tài)。見表1。

2.3 胰腺及腎病理變化。

2.3.1 胰腺病理變化 A組在造模后24 h，胰腺水腫伴充血出血，胰腺實(shí)質(zhì)大片凝固性壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B組在造模后24 h，胰腺充血水腫程度較輕，局部胰腺點(diǎn)狀壞死，少量間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C組無病理改變。見圖1。

2.3.2 腎病理變化 A組在造模后24 h腎小球瘀血，間質(zhì)水腫充血增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管管腔擴(kuò)大，管壁細(xì)胞呈扁平狀，刷狀緣損傷、脫落，細(xì)胞漿空泡形成，腎小管上皮細(xì)胞可見廣泛壞死，管腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞及其他管型。B組在治療后24 h腎小管上皮細(xì)胞水腫，間質(zhì)水腫，腎小管偶見上皮細(xì)胞壞死，刷狀緣損傷、細(xì)胞漿空泡形成、腎小管腔可見管型、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較A組減輕；C組無病理改變。見圖2。

2.4 血清及腹水NF-κB濃度結(jié)果 A組和B組造模后各時(shí)間點(diǎn)血清NF-κB濃度較C組顯著升高(P<0.05)；B組與A組比較，各時(shí)間點(diǎn)血清及腹水NF-κB濃度顯著下降(P<0.05)。且隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸達(dá)到穩(wěn)態(tài)。見表2。

2.5 觀察及分析腎組織NF-κB免疫組化結(jié)果 顯微鏡下可見：C組大鼠腎組織中NF-κB(棕褐色物質(zhì))分布稀疏、零星存在；A組大鼠中棕褐色物質(zhì)較C組多、呈密集分布；而B組棕褐色物質(zhì)較A組少、呈散在分布(圖3)?；叶戎禍y(cè)定結(jié)果顯示：與C組比較,A組和B組NF-κB染色平均灰度值明顯升高(P<0.05)；B組與A組比較,灰度值明顯降低(P<0.05)。

表1 兩組術(shù)后不同時(shí)間血清及腹水淀粉酶活性比較(U/L，n=8)

注：與同時(shí)間C組比較，①P<0.05；與同時(shí)間A組比較，②P<0.05

圖1 造模后24 h各組大鼠胰腺組織病理變化(HE ×200)

圖2 造模后24 h各組大鼠腎組織病理變化(HE ×200)

時(shí)間(h)血清NF-κBA組 B組 C組 腹水NF-κBA組B組678.175±7.344①47.500±8.069①②28.500±3.70278.675±7.21630.700±6.696②1284.300±10.365①57.050±5.325①②31.863±3.25885.363±7.89831.840±4.645②24101.462±7.952①50.138±8.221①②29.212±5.12184.363±11.02231.025±6.816②

注：與同時(shí)間C組比較，①P<0.05；與同時(shí)間A組比較，②P<0.05

圖3 造模后24 h各組大鼠腎組織NF-κB免疫組化結(jié)果(HE ×200)

3 討論

有資料表明，SAP時(shí)產(chǎn)生大量的胰腺炎相關(guān)性腹水(pancreatitis associated ascitic fluid，PAAF)，其中的彈性蛋白酶和多種毒性細(xì)胞因子和介質(zhì)可經(jīng)腹膜吸收入血，通過不同的分子機(jī)制導(dǎo)致SAP時(shí)腎功能的損害[5]。SAP產(chǎn)生的大量PAAF內(nèi)含有多種毒性和有害物質(zhì)，如內(nèi)毒素、淀粉酶、脂肪酶、彈性蛋白酶、磷脂酶A、丙二醛、游離脂肪酸以及腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)，它們對(duì)SAP的病情發(fā)展有著不可低估的影響。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，早期激活的NF-κB可能是各種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的“閘門”，通過“扳機(jī)樣”作用觸發(fā)炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成SAP的炎癥蔓延、惡化[6]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)的過度激活是SAP發(fā)生腎衰竭的重要因素，控制SAP炎癥程度，有利于減輕腎損傷[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，A組與B組造模后6 h淀粉酶開始升高，并開始出現(xiàn)腹水，腹水和血清中NF-κB濃度也開始增高。而腹腔置管引流組通過將腹水引流出體外，腹水中淀粉酶、NF-κB的濃度顯著下降，血清中NF-κB的濃度隨之下降。鮑世韻等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過腹腔鏡下腹腔置管引流治療豬SAP，引流組血漿NF-κB含量較對(duì)照組顯著下降，表明腹腔鏡下腹腔置管引流能夠有效減輕SAP豬過度的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相似，說明通過腹腔置管引流治療，可以有效引流出腹水中大量的炎癥因子及各種有毒物質(zhì)，減少各種有毒物質(zhì)吸收入血。A組與B組較C組各時(shí)相點(diǎn)腎NF-κB免疫組化表達(dá)升高，腎組織病理變化明顯加重；B組較A組各時(shí)相點(diǎn)腎NF-κB免疫組化表達(dá)明顯減少，腎組織病理變化減輕，但與C組仍有差距。說明炎癥因子參與了腎損傷，通過腹腔引流將腹水NF-κB引流出體外，減少了炎癥因子吸收入血，減輕了全身炎癥反應(yīng)程度[9]。全身的炎癥程度減輕，炎癥因子對(duì)腎組織損害減少，減輕了腎的損傷。

腹腔置管引流治療減輕了腎損傷，有利于防止腎功能衰竭，分析其作用機(jī)制可能是：腹腔置管引流能及時(shí)將含有大量高活性消化酶類、內(nèi)毒素以及炎癥介質(zhì)的血性腹腔積液迅速排出體外，減少了腹腔積液中大量有毒物質(zhì)的吸收。尤其是各種炎癥因子的釋放減少，阻斷了SAP發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時(shí)也有利于防止內(nèi)毒素刺激單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子而引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，減輕了腎損傷，從而有利于改善SAP病情。

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Experimental study on effects of intraperitoneal catheter drainage on renal injury of rats with severe acute pancreatitis

Zhou Chao1,2,Zheng Xiaobo1,Chen Guangyu1,Liu Yan3,Li Pengwu1,Jiang Zhiwei1,Tang Lijun1

1.Center for General Surgery,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,the Sixth People's Hospital of Chengdu City,Chengdu,Sichuan,610051,China;3.Department of Senile Diseases,the Fifth People's Hospital of Chengdu City,Chengdu,Sichuan,611130,China

Objective To investigate the effects of intraperitoneal catheter drainage on the renal injury of rats with severe acute pancreatitis(SAP)and its mechanism.Methods Seventy two rats were randomly divided into SAP group(group A),SAP drainage group(group B),and the sham operation group(group C)with 24 ones in each group.There were examinational time points,i.e.6,12,and 24 h,and each time point was allocated with 8 rats.In group A,SAP model was established through retrograde cholangiopancreatography injection with sodium taurocholate.Group B

intraperitoneal catheter drainage based on the same treatment as group A.Group C received only the laparotomy.The rats' blood,ascites,pancreatic gland,and nephridial tissue samples were obtained 6,12,and 24 h after the treatment in order to detect the level of amylase and NF-κB in blood and ascites.HE staining was carried out for pancreatic and nephridial tissues in order to observe the pathological changes.Immunohistochemical method was used to detect the expression level of NF-κB in nephridial tissues.Results Compared with the levels of group C,the levels of amylase and NF-κB in blood and ascites of group A and B increased significantly,and pathological changes occurred in pancreatic and renal tissues.The expression of NF-κB increased in renal tissues.The preoperative pathological changes in group B significantly decreased compared with those in group A.Conclusion Intraperitoneal catheter drainage can relieve the kidney injury in rats with severe acute pancreatitis.

rat;severe acute pancreatitis;intraperitoneal catheter drainage;kidney injury;NF-κB

四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)基金資助課題，四川省2011年第五批科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011JTD0010)

610083 成都，成都軍區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心(周 超，鄭曉博，陳光宇，黎鵬武，蔣志偉，湯禮軍)；成都市第六人民醫(yī)院肝膽外科(周 超)；成都市第五人民醫(yī)院老年病科(劉 彥)

湯禮軍，E-mail:whjtlj@yahoo.com.cn

R 691.6/692

A

1004-0188(2014)02-0129-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.005

2013-03-02)