MTHFR基因多態(tài)性及同型半胱氨酸與維吾爾族人群靜脈血栓栓塞癥的相關(guān)性研究

凱麗比努爾·阿布都熱合曼， 艾力曼·馬合木提， 夏玉寧， 胡雪梅

(1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 烏魯木齊 830001； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心， 烏魯木齊 830054)

肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)與深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)在發(fā)病機(jī)制上存在相互關(guān)聯(lián)，是同一種疾病病程中2個(gè)不同階段的不同臨床表現(xiàn)，統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)[1]。目前已有關(guān)于亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多態(tài)性及同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平與VTE的相關(guān)性的研究報(bào)道[2-4]。維吾爾族人群白細(xì)胞抗原血清學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，維吾爾族既具有某些高加索人種的基因特征，又具有某些東亞蒙古人種的基因特征，遺傳特性介于二者之間[5]。近年來(lái)，新疆地區(qū)有關(guān)動(dòng)脈血栓性疾病的研究較多，且發(fā)現(xiàn)冠心病[6]、高血壓[7]等疾病在維吾爾族、哈薩克族等少數(shù)民族中的發(fā)病及危險(xiǎn)因素分布存在民族異質(zhì)性。靜脈血栓與動(dòng)脈粥樣硬化在發(fā)病機(jī)制上存在關(guān)聯(lián)性[8-9]。因此，需要對(duì)維吾爾族患者在靜脈血栓栓塞性疾病發(fā)病機(jī)制及流行病學(xué)方面進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。本研究通過(guò)采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制片長(zhǎng)多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)MTHFR基因C677T位突變，并用酶循環(huán)法測(cè)定血漿Hcy水平，評(píng)價(jià)MTHFR基因C677T突變及Hcy水平與維吾爾族人群VTE發(fā)生的直接獨(dú)立關(guān)聯(lián)。從分子流行病學(xué)思路多角度探討維吾爾族人群VTE患者基因缺陷，識(shí)別高危人群。此外，通過(guò)了解傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素在病例及對(duì)照人群中的分布情況，評(píng)價(jià)其對(duì)維吾爾族人群VTE發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2008年1月-2012年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科、呼吸科、血管外科、急診科以及重癥監(jiān)護(hù)室連續(xù)收治的有完整資料的維吾爾族VTE患者94例為VTE組，男性45例，女性49例，年齡 18～75歲，平均(51.61±13.69)歲。VTE病例組中DVT患者30例(31.9%)，PTE 患者50例(53.2%)，DVT合并PTE 患者14例(14.9%)。健康對(duì)照組86例為本院同期維吾爾族住院體檢患者，其中男性45例，女性41例，平均年齡(53.48±13.59)歲。VTE組及對(duì)照組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

VTE診斷標(biāo)準(zhǔn)按照歐洲心臟學(xué)會(huì)2008年指南[1]。PTE的確定診斷標(biāo)準(zhǔn)為符合下列任意一項(xiàng)者：(1)選擇性肺動(dòng)脈造影顯示肺動(dòng)脈阻塞或充盈缺損；(2)肺動(dòng)脈螺旋CT顯示肺動(dòng)脈內(nèi)的低密度充盈缺損或完全充盈缺損；(3)放射性核素肺灌注、通氣顯像顯示病灶部位血流灌注缺失，而通氣正常或接近正常；(4)超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈腔內(nèi)異?；芈?，提示栓子者；(5)臨床診斷有明確的危險(xiǎn)因素，結(jié)合臨床表現(xiàn)及輔助檢查(心電圖、心臟彩超、雙下肢超聲、胸片、血?dú)夥治龊虳-二聚體)等提示不能解釋的低碳酸血癥、胸部X線顯示單側(cè)肺紋理稀疏、右心室負(fù)荷加重的心電圖表現(xiàn)等聯(lián)合診斷。深靜脈血栓(DVT)的確定診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)靜脈造影、彩色多普勒血流顯像、下肢深靜脈核素顯像、CT靜脈造影、磁共振靜脈造影、單純多普勒血管檢查中任意一項(xiàng)檢查顯示深靜脈管腔阻塞或充盈缺損改變，伴或不伴有DVT臨床表現(xiàn)者。所有研究對(duì)象在納入研究前均簽署知情同意書。

1.3 方法

使用血液基因組DNA中計(jì)量抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)在20 μL反應(yīng)體系中，含上、下游引物(F：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′；R：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′)各0.5 μL，dNTP10 μL，基因組DNA2 μL，10×PCR緩沖液7 μL，DNA聚合酶(博邁德)1 U，置于PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)中。循環(huán)條件為： 94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，退火溫度61 ℃，1 min，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析：在20 μL反應(yīng)體系中，含有PCR產(chǎn)物10 μL，ddH2O 7 μL，酶切Buffer 2 μL，內(nèi)切酶HinfⅠ(Fermentas 公司)1 μL，37℃水浴16 h，3%瓊脂糖凝膠-核酸染料(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，115 V電泳30 min，紫外線下觀察，攝影。將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物與DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物比較，以鑒定基因型。隨機(jī)選取24例研究對(duì)象的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將其 PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序。采用酶循環(huán)法進(jìn)行血漿Hcy水平監(jiān)測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因C677T突變的基因型分型

VTE組和對(duì)照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對(duì)象來(lái)自同一群體，具有較好的代表性。MTHFR基因C677T位點(diǎn)目的片段長(zhǎng)度198 bp，根據(jù)酶切后片段長(zhǎng)度的不同分為3種基因型：TT純合子，包含175 bp和23 bp 2個(gè)片段；CT雜合子，包含198、175和23 bp 3個(gè)片段；CC野生型，只含198 bp 1個(gè)片段，測(cè)序結(jié)果和酶切分析結(jié)果一致(圖1、2)。

2.2 MTHFR基因型分布及等位基因頻率比較

研究對(duì)象符合Hardy Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。VTE組和對(duì)照組中，CC、CT、TT基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.043，P=0.000)。VTE組中，C、T等位基因頻率分別為45.74%和54.25%；對(duì)照組中，C、T等位基因頻率分別為61.05%和38.95%，兩組等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.444，P=0.004)。攜帶有T等位基因的較攜帶有C等位基因的人群發(fā)生VTE的風(fēng)險(xiǎn)為1.859(95%CI=1.221～2.828，P=0.004)，見表1。

2.3 不同性別MTHFR基因C677T突變基因型和等位基因分布的比較

男性維吾爾族人群中，VTE組與對(duì)照組MTHFR基因C677T突變的基因型及等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶有T等位基因個(gè)體發(fā)生VTE的危險(xiǎn)性高于攜帶有C等位基因個(gè)體發(fā)生，其OR值為2.053(95%CI=1.133～3.718)。而女性維吾爾族人群中，VTE組與對(duì)照組MTHFR基因C677T突變的基因型及等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 維吾爾族MTHFR基因C677T基因分布及等位基因頻率的比較/例(%)

表2 維吾爾族VTE患者性別與MTHFR基因C677T多態(tài)性的關(guān)系/例(%)

2.4 兩組不同MTHFR基因型血漿Hcy比較

VTE組血漿Hcy水平高于對(duì)照組，VTE組中，TT基因型的血漿Hcy水平高于CT和CC基因型(P<0.05)，見表3。

表3 維吾爾族MTHFR基因C677T突變各基因型之間血漿Hcy水平

3 討論

MTHFR基因按孟德爾常染色體隱性方式遺傳，在人群分布呈遺傳多態(tài)性。已有研究表明，根據(jù)地域、種族的不同，MTHFR基因C677CT突變頻率的分布存在差異[10-12]。非洲人群MTHFR基因C677T純合子基因型頻率(1%～2%)明顯低于歐洲人群，意大利人C677T純合子基因型頻率為25%，677T 等位基因頻率為50.5%[10]。居住在巴西和美國(guó)的非洲人后裔677T等位基因頻率為5%～24%[11]。日本人677T等位基因頻率為34%。我國(guó)貴州布依族、漢族、苗族人群中MTHFR基因C677T突變純合子基因型頻率分別為0.9%、2.2%、28%，T等位基因的分布頻率分別為16.1%、22.8%、10.6%[12]。本研究結(jié)果顯示，維吾爾族正常對(duì)照組MTHFR基因C677T突變T純合型突變?yōu)?2.79%，野生型突變?yōu)?4.88%，雜合基因型突變率為52.33%，其分布特點(diǎn)不同于以上研究，其可能的原因是MTHFR C677T分布的復(fù)雜性，可能受到人種、地域、民族、地理環(huán)境等多種因素的共同影響。

已有研究表明，高Hcy血癥是動(dòng)脈血栓性疾病和靜脈血栓性疾病的危險(xiǎn)因素[13-14]，然而到目前為止MTHFR基因多態(tài)性與VTE的相關(guān)性仍然沒(méi)有定論[15]。有一項(xiàng)包括包括4 901例病例及7 886例對(duì)照研究的Meta分析結(jié)果顯示，MTHFR基因C677T多態(tài)性與VTE的發(fā)病危險(xiǎn)有著輕微的關(guān)聯(lián)，并非是VTE的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因子[16]。本研究顯示，94例VTE患者和86例健康者M(jìn)THFR基因C677T突變位點(diǎn)基因型分布及等位基因攜帶頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，VTE組MTHFR基因TT型分布明顯高于對(duì)照組，提示MTHFR基因C677T突變TT基因型及T等位基因可能是維吾爾族VTE的一個(gè)遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。此外，在進(jìn)一步的性別比較中發(fā)現(xiàn)，男性VTE組與對(duì)照組MTHFR基因頻率及等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VTE組T等位基因頻率高于對(duì)照組(分別為57.78%和40.00%)，其攜帶T等位基因個(gè)體發(fā)生VTE的風(fēng)險(xiǎn)高于C等位基因個(gè)體(OR= 2.053,P<0.05)，可以推測(cè)T等位基因是維吾爾族男性VTE的易感因子之一。而女性VTE組與對(duì)照組MTHFR基因基因型和等位基因分布頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，由于本研究樣本量有限，結(jié)論有待于加大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

MTHFR在半胱氨酸代謝中有關(guān)鍵酶，MTHFR的缺陷將造成Hcy在血液中堆積而引起Hcy血癥。高Hcy在金屬離子介導(dǎo)下自身氧化生成過(guò)氧化物及氧自由基，損傷內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而使內(nèi)皮素-1分泌增加，前列腺素及血管內(nèi)皮衍生松弛因子分泌減少，使血管舒縮因子的平衡紊亂，從而發(fā)生及促進(jìn)血栓的形成[17]。有大量的研究顯示，高Hcy與動(dòng)、靜脈血栓栓塞性疾病有著緊密的關(guān)聯(lián)，高Hcy不僅是動(dòng)脈硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，而且也是VTE的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[18]。陸艷輝等[19]測(cè)定69例PTE患者與90例年齡、性別匹配的健康對(duì)照者的空腹Hcy水平，結(jié)果PTE組空腹Hcy水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Hcy水平升高的患者患有PTE的風(fēng)險(xiǎn)為3.99，認(rèn)為高Hcy是國(guó)人PTE的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。邱玲等[20]研究發(fā)現(xiàn)，69例Hcy DVT患者比102例健康對(duì)照患者的血漿Hcy水平高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR值為2.53，認(rèn)為Hcy水平輕度升高可能會(huì)增加我國(guó)北方地區(qū)漢族人群發(fā)生DVT的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果提示，VTE組血漿Hcy水平為(24.4±9.42)μmol/L，明顯高于健康對(duì)照組的(13.5±5.21 μmol/L,P=0.003)，提示Hcy與維吾爾族VTE關(guān)系密切。此外，VTE人群血漿Hcy水平與MTHFR基因型有關(guān)，即TT基因型所對(duì)應(yīng)的個(gè)體血漿Hcy水平較CT型及CC型所對(duì)應(yīng)個(gè)體血漿Hcy水平高。遺傳、環(huán)境、飲食、職業(yè)、情感等多種因素會(huì)影響血漿Hcy水平，在忽略環(huán)境等外部因素的影響下，相關(guān)代謝酶的基因突變引起該酶缺陷或活性下降，從而引起Hcy升高可能是發(fā)生VTE的原因之一。

本研究初步表明，維吾爾族人群MTHFR基因C677T多態(tài)性及血漿Hcy水平與VTE的發(fā)病有關(guān)，MTHFR 677C/T基因突變及高Hcy血癥可能與維吾爾族人群發(fā)生VTE相關(guān)。通過(guò)測(cè)定MTHFR基因型及血漿Hcy水平有助于預(yù)測(cè)和干預(yù)維吾爾族高危人群，從而減少VTE患者反復(fù)發(fā)病，對(duì)提高VTE患者生活質(zhì)量具有十分重要的臨床意義。

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