維吾爾族婦女宮頸癌與新一類腫瘤特異性上調(diào)表達基因調(diào)控的關(guān)系研究

吐爾遜帕夏·吾布力卡斯木， 瑪依拉·卡米力江， 劉開江， 希爾扎提·蘇來曼，熱孜萬古麗·約麥爾， 哈麗丹·熱依木， Abulizi Abudula,4

(新疆醫(yī)科大學1維吾爾醫(yī)學院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學教研室， 3附屬腫瘤醫(yī)院婦科,4新疆地方病分子生物學實驗室， 烏魯木齊 830011)

新疆維吾爾族婦女是我國宮頸癌高發(fā)人群，其有效治療的關(guān)鍵是早期發(fā)現(xiàn)。但是，由于現(xiàn)有臨床技術(shù)對腫瘤的早期診斷能力有限，多數(shù)(中晚期)患者往往失去治療良機[1-2]。腫瘤特異性差異表達基因的篩選是建立腫瘤分子診斷方法并實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)的重要前提。以往報道中，通過宮頸癌與正常組織、宮頸鱗癌與腺癌以及宮頸癌早期與晚期的組織的全基因組表達譜芯片研究，發(fā)現(xiàn)一系列宮頸癌特異性差異表達基因[3-6]。但是，也發(fā)現(xiàn)基因表達譜存在人群或族群差異，可能與遺傳背景、生活環(huán)境和流行病學特征等有一定的關(guān)系[7-9]。在前期研究中，研究維吾爾族婦女宮頸癌的全基因組表達譜芯片研究，發(fā)現(xiàn)一系列新的腫瘤特異性上調(diào)表達基因。故本研究采用半定量RT-PCR方法對6種發(fā)現(xiàn)的上調(diào)表達基因進行半定量鑒定，探討宮頸癌發(fā)生與這些基因差異表達的關(guān)系，豐富宮頸癌早期預警指標體系，為宮頸癌預防、早期發(fā)現(xiàn)及有效治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集

收集2010-2011年在新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院住院治療并確診的72例維吾爾族婦女宮頸病變患者的新鮮組織標本，其中CSCC為25例，CINⅡ～Ⅲ為22例，正常對照組為25例(主要是取自全子宮切除患者)。所有入選病例術(shù)前均未接受化療或放療，同時排除患有其他惡性腫瘤的患者，平均年齡為45.2歲(25～69歲)。

1.2 儀器和試劑

RNA提取相關(guān)的試劑由Qiagen公司提供。cDNA合成和PCR分析試劑分別為Fermentas和TAKARA公司產(chǎn)品。酚/氯仿、異丙醇和乙醇等化學試劑選自天津盛森精細化工公司，均為優(yōu)級純等級。主要儀器有高速低溫離心機(Allegra-64R，Beckmann Coulter)、核酸/蛋白快速測定儀(GeneQuant-Ⅱ，GE公司)、PCR儀(iCycler，Biorad)和核酸凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-XR，Biorad)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織總RNA的制備 取新鮮冷凍組織50～100 mg，在液氮冷凍狀態(tài)下碾碎，采用傳統(tǒng)的Trizol法提取組織總RNA。測定濃度和OD260/280,并電泳檢測RNA 的完整性，保存于-80℃冰箱。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 在前期對維吾爾族婦女宮頸癌的全基因組表達譜研究的基礎(chǔ)上，選取SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B 6種上調(diào)表達候選基因,并根據(jù)上述基因的RNA信息，設(shè)計每一種候選基因mRNA序列特異性PCR引物(表1)。

表1 候選上調(diào)表達基因的mRNA序列特異性引物

1.3.3 半定量RT-PCR方法 (1)根據(jù)組織總RNA濃度，取2 μg組織RNA，采用Fermentas試劑盒合成cDNA；(2)根據(jù)基于全基因組表達譜芯片分析，進一步選擇特定候選上調(diào)表達基因，利用Genbank數(shù)據(jù)庫檢索，獲得mRNA序列，設(shè)計與合成其特異性引物(引物均由TAKARA公司合成并經(jīng)質(zhì)量檢測)；(3)以1 μL cDNA為模板，采用25 μL PCR體系，經(jīng)預試驗優(yōu)化PCR條件后，對所有標本的cDNA模板進行PCR擴增，設(shè)PCR擴增程序為預變性95℃ 3 min,變性94℃ 45 s,35個循環(huán)、退火58～64℃ 45 s和合成72℃ 1.5 min,延長72℃/7 min。每次PCR擴增中，均設(shè)內(nèi)參基因管和空白對照(dd H2O)。利用2%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，經(jīng)凝膠成像分析后，利用Quantity One軟件(凝膠成像儀自備軟件)對PCR產(chǎn)物條帶進行灰度值分析。候選基因的轉(zhuǎn)錄表達水平=目標基因的PCR產(chǎn)物灰度值/內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

利用半定量RT-PCR方法，通過6種基因在宮頸癌、癌前病變及正常對照組內(nèi)mRNA表達水平分析，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗證可知擴增片斷長度和理論大小一致，且擴增條帶單一，說明該引物有高度特異性(圖1)。

CSCC與宮頸炎SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B 6種基因mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),6種基因是宮頸癌特異性上調(diào)表達(高)基因，其中SHISA2、SIX1、DTL、DSG2和NUP62CL 5種基因表達水平差異更為顯著(P<0.01)，可能更具有代表性。CSCC與CINⅡ～Ⅲ比較, SHISA2、SIX1、APOBEC3B和DSG2 4種基因表達水平存在顯著差異(P<0.05)，其檢測可能有助于鑒別腫瘤與癌前病變。CIN與宮頸炎比較發(fā)現(xiàn)只有SHISA2基因的表達水平存在差異(P<0.05)(表2)。

表2 6種宮頸病變組織特異性上調(diào)表達基因的半定量RT-PCR分析

3 討論

宮頸癌是嚴重危害新疆維吾爾族婦女健康的一種疾病,因而宮頸癌的研究不僅可以解決腫瘤研究領(lǐng)域的共同問題,而且也是新疆腫瘤防治工作的重點, 一直倍受關(guān)注。宮頸癌發(fā)生發(fā)展是多步驟、多基因表達調(diào)控紊亂的復雜過程。因此，采用高通量檢測技術(shù)——基因芯片對宮頸病變組織分析,一次實驗就可觀察某組織中成千上萬個基因的表達變化,從而可以在整個基因組范圍內(nèi)進行基因表達并行分析,適合于對宮頸癌相關(guān)功能基因的大規(guī)模研究。

劉開江等[10]通過宮頸癌組織的人類全基因組芯片分析，發(fā)現(xiàn)了一系列宮頸癌組織特異性差異表達基因。本課題組在前期工作中，發(fā)現(xiàn)了新的宮頸癌特異性上調(diào)表達基因群，其中有SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B等。在此基礎(chǔ)上，本研究對手術(shù)切除宮頸鱗癌、CINⅡ～Ⅲ及正常宮頸組織RNA進行半定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)6種基因在維吾爾族婦女宮頸癌、癌前病變及正常對照組內(nèi)mRNA表達水平有差異。CSCC與宮頸炎之間SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B 6種基因mRNA表達水平均存在統(tǒng)計學差異，在CIN與宮頸炎之間僅發(fā)現(xiàn)SHISA2基因的表達水平差異顯著。由于在CSCC與CINⅡ～Ⅲ之間SHISA2、SIX1、APOBEC3B和DSG2 4種基因表達水平差異也有統(tǒng)計學意義，其檢測可能有助于鑒別腫瘤與癌前病變。上述候選基因中SIX1、DTL、DSG2基因mRNA表達水平在CSCC組織中最高，在CIN下降，在宮頸炎最低，但是SHISA2和NUP62CL 基因在CSCC組織中的表達水平低于CIN，APOBE63B基因在CIN組織中的表達水平低于宮頸炎。

SHISA2基因是Wnt、FGF信號途徑的抑制因子，在胚胎發(fā)育過程中，特別是在內(nèi)臟內(nèi)胚層、體節(jié)、前腦、視泡和肢芽等器官的發(fā)育過程中起著重要作用[11 ]，該基因與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系尚未見報道。SIX1基因是最近發(fā)現(xiàn)的一種新同源盒基因[12], 最初的研究表明SIX1基因與組織器官的發(fā)育有關(guān),可在細胞分化前促進前體細胞的增生和生存，此外SIX1基因還可促進細胞遷移、侵襲和產(chǎn)生間充質(zhì)細胞表型[13]。當SIX1調(diào)控異常時,不但使胚胎發(fā)育和組織器官出現(xiàn)異常形態(tài)結(jié)構(gòu)、胚胎死亡,而且在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。例如, SIX1在乳腺癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤中表達量增高[12，15-16]。鄭秀惠等[13]發(fā)現(xiàn)該基因在宮頸癌組織中高表達。可見，SIX1基因的異常表達可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和促進腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)合本研究結(jié)果，可以推測SIX1基因轉(zhuǎn)錄表達水平上調(diào)確實與宮頸病變進程密切相關(guān)。DTL[denticle less homolog (Drosophila)]果蠅同源盒基因，表達于許多成人組織中，如上皮、乳腺、結(jié)腸、腎、睪丸及各級造血細胞中。目前國內(nèi)外關(guān)于DTL基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機制的研究甚少，Baraniskin等[17]發(fā)現(xiàn)該基因在結(jié)腸癌中高表達，提示該基因可能在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但其在宮頸癌中的作用及發(fā)病機制國內(nèi)外尚無研究報道。DSG2( desmoglein 2)基因是沉默橋粒芯糖蛋白家族的成員之一，其低表達導致多種心肌相關(guān)基因表達改變,細胞凋亡增加,縫隙連接蛋白43、離子通道蛋白和心肌發(fā)育相關(guān)蛋白表達改變可能參與了心律失常性右室心肌病(ARVC)的發(fā)病[18]。APOBEC3B (Apolipoprotein mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類哺乳動物物胞苷脫氨酶Apobec3蛋白酶家族的成員，是一種RNA/DNA編輯酶在研究中發(fā)現(xiàn)APOBEC3家族并非在所有組織中都有很高的表達,而僅在一些細胞系如鱗狀細胞、結(jié)腸、小腸、睪丸、卵巢、結(jié)腸癌、Burkitfs淋巴瘤,慢性淋巴細胞白血病中相對表達增高[19]。目前對APOBEC3B基因的大多數(shù)研究主要與肝臟腫瘤發(fā)生及其機制有關(guān)，而針對其他腫瘤病變的研究報道很少，對于該基因與宮頸癌發(fā)生發(fā)展之間的研究幾乎空白。

在本研究進行的同時本課題組對下調(diào)表達基因與維吾爾族婦女宮頸病變病理進程的關(guān)系進行探討，發(fā)現(xiàn)DNASE1L3、EGR1、FOS、KLF和IER2 5種基因的表達水平變化可能成為宮頸癌早期預警指標[20]。從蛋白質(zhì)表達水平檢測可以更明確mRNA表達水平的差異，因而利用免疫組織化學和免疫印跡等方法進一步篩選并研究對低表達基因啟動子甲基化水平變化與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系，是本研究的后續(xù)工作任務。HPV是宮頸癌發(fā)生的危險因素，從HPV感染水平探討上調(diào)表達基因，有助于了解上調(diào)表達候選基因表達水平變化與病毒感染的機制。

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