綠原酸對(duì)體外培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的作用

姚素艷，李全勝，鄭德宇

(1. 遼寧醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001；2. 盤錦市中心醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧盤錦 124000；3. 遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

◇中醫(yī)藥研究◇

綠原酸對(duì)體外培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的作用

姚素艷1，李全勝2，鄭德宇3

(1. 遼寧醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001；2. 盤錦市中心醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧盤錦 124000；3. 遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

目的 探討綠原酸(chlorogenic acid, CHA)對(duì)體外培養(yǎng)狀態(tài)下人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的作用及其機(jī)制。方法 在無(wú)菌狀態(tài)下復(fù)蘇人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1，取傳4代的細(xì)胞，向培養(yǎng)基內(nèi)加入CHA，使其終濃度達(dá)到0、25、50、100、200、500 μmol/L，應(yīng)用CCK-8體外抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選CHA的最佳抑癌濃度。選擇CHA最佳抑癌濃度，作用于CNE-1細(xì)胞系。檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中端粒酶活性、抑癌基因p27和p16的表達(dá)、細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1)和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK4)的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)CCK-8體外抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選CHA的最佳抑癌濃度為100 μmol/L。人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的培養(yǎng)基中加入終濃度為100 μmol/L的CHA，維持10 d，CNE-1細(xì)胞株中其端粒酶活性為1.621，遠(yuǎn)低于試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照和未處理的CNE-1細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。應(yīng)用CHA處理CNE-1細(xì)胞株10 d后，抑癌基因p27和p16均有少量的表達(dá)，而在陽(yáng)性對(duì)照組(HT1080細(xì)胞)和未處理的CNE-1細(xì)胞幾乎沒(méi)有表達(dá)。應(yīng)用CHA處理CNE-1細(xì)胞株10 d后，cyclin D1和CDK4的表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組(HT1080細(xì)胞)和未處理的CNE-1細(xì)胞相比明顯降低。結(jié)論 應(yīng)用100 μmol/L CHA 10 d，可以降低CNE-1細(xì)胞株端粒酶活性、增加抑癌基因的表達(dá)，降低細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。CHA對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的作用是通過(guò)活化抑癌基因和抑制細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綠原酸；鼻咽癌；抑癌基因；細(xì)胞周期蛋白；端粒酶；p27；p16

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)最常見(jiàn)頭頸部惡性腫瘤，是威脅人類健康的十大惡性腫瘤之一[1-2]。由于鼻咽部特殊的解剖學(xué)位置，發(fā)病時(shí)多為中晚期，手術(shù)根治非常困難[3-4]。臨床上手術(shù)治療只是一種輔助治療手段，放療或放化綜合治療已成為鼻咽癌的主要治療手段。研究發(fā)現(xiàn)p27和p16均為抑癌基因，在各種類型的腫瘤細(xì)胞中，幾乎都有p27蛋白的表達(dá)降低[5]。p16蛋白能抑制細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。細(xì)胞周期蛋白(cyclin)和細(xì)胞周期素依賴激酶4、6(cyclin dependent kinases, CDK 4，6)結(jié)合后[6]，促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。由于p16蛋白氨基末端具有與Cyclin D1的周期素編碼區(qū)同源的區(qū)域，故p16可能與Cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)CDK4/CDK6的結(jié)合位點(diǎn)，抑制其激活酶活性，從而達(dá)到抑制細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。在NPC組織中，p27和p16陰性表達(dá)率分別為61%～85%和71%～88%，Cyclin D1和CDK4的陽(yáng)性表達(dá)率分別為56%～58%和61%～75%[7-8]。

綠原酸(chlorogenic acid, CHA)是金銀花(houneysuckle flowers)的生物活性提取物，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[9-10]。以往的研究發(fā)現(xiàn)金銀花的抑癌作用主要體現(xiàn)在CHA對(duì)肉瘤180及艾氏腹水癌有明顯的細(xì)胞毒作用。CHA對(duì)于鼻咽癌的作用尚沒(méi)有明確的報(bào)道。如果人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1在一定濃度的CHA的作用下，出現(xiàn)p27表達(dá)上調(diào)，CDK4下調(diào)，p16表達(dá)上調(diào)，cyclin D1的表達(dá)降低，則可以初步說(shuō)明CHA具有一定的抑制人鼻咽癌的作用，可能為鼻咽癌的治療提供一個(gè)新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；CHA(金銀花提取物，分子質(zhì)量為354.30，純度>98%，購(gòu)自山東金宇桐生物有限公司)。高糖DMEM、胰蛋白酶和二甲基亞砜(DMSO)(Gibco公司)、新生牛血清(Hyclone)、CCK8試劑盒、p27單克隆抗體、CDK4單克隆抗體、Cyclin D1單克隆抗體、p16單克隆抗體(Sigma公司)、端粒酶ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德)。

1.2 鼻咽癌細(xì)胞株的復(fù)蘇及培養(yǎng) 從液氮罐中取出鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1細(xì)胞凍存管，常規(guī)方法復(fù)蘇，以106/mL的濃度接種于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，即細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入5 mL 的PBS(0.1 mol/L，pH=7.4)緩沖液洗滌細(xì)胞，然后吸棄PBS緩沖液，加入胰蛋白酶(含0.2 g/L EDTA)后置于室溫消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞大部分突起回縮，加入上述培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞移到一個(gè)15 mL離心管中以1 000 r/min離心5 min，吸棄上清，加入5 mL完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度，按1×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求取傳4代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CHA最適濃度的篩選

①細(xì)胞培養(yǎng)。將CNE-1細(xì)胞分為6組：陰性對(duì)照組(未加任何處理，同期培養(yǎng)的同代次細(xì)胞)；CHA組1：在培養(yǎng)基中加入CHA，終濃度為25 μmol/L。CHA組2：在培養(yǎng)基中加入CHA，終濃度為50 μmol/L處理3 d。CHA組3：在培養(yǎng)基中加入CHA，終濃度為100 μmol/L處理3 d。CHA組4：在培養(yǎng)基中加入CHA，終濃度為200 μmol/L處理3 d。CHA組5：在培養(yǎng)基中加入CHA，終濃度為500 μmol/L處理3 d。陽(yáng)性對(duì)照組：在培養(yǎng)基中加入雷公藤提取物，終濃度為100 μmol/L處理3 d。

②體外CCK-8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔約100 μL(2 000個(gè)細(xì)胞/孔)，向培養(yǎng)基內(nèi)加入CHA原液，使終濃度分別為0、25、50、100、200、500 μmol/L，每個(gè)濃度重復(fù)3次，將細(xì)胞放置于50 mL/L CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h(即細(xì)胞在不同濃度的CHA作用下維持藥物濃度6 d，根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，6 d時(shí)作用效果達(dá)到最佳)。向每孔中加入CCK-8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，待完全顯色，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔的吸光度A值。按公式計(jì)算出增殖率：細(xì)胞增殖率(%)=[實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值]×100%。通過(guò)增殖率，可以初步判定CHA對(duì)CNE-1的最適抑制濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇此濃度為實(shí)驗(yàn)濃度。

③繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。根據(jù)上一結(jié)果獲得的濃度，為了進(jìn)一步確定最佳的抑制濃度，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種500 μL細(xì)胞懸液(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)，每組設(shè)4個(gè)平行孔。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)加入0、75、100、125、150 μmol/L不同濃度CHA溶液，加入CCK8進(jìn)行檢測(cè)，連測(cè)7 d。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，進(jìn)一步確定CHA抑制CNE-1生長(zhǎng)的最佳濃度。其中：增殖率=CHA組吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值×100%。

1.4 CHA對(duì)CNE-1增殖的影響

①應(yīng)用ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)端粒酶活性。取傳4代的CNE-1，向培養(yǎng)基中加入CHA至其終濃度為100 μmol/L，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常的傳代培養(yǎng)，維持該濃度10 d。收集細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性PCR-ELISA檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照組采用人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞株(中科院細(xì)胞庫(kù))，陰性對(duì)照為試劑盒自備樣品。

②抑癌基因p27、p16和CDK4及Cyclin D1的檢測(cè)。取傳4代的CNE-1，向培養(yǎng)基中加入CHA至其終濃度為100 μmol/L，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常的傳代培養(yǎng)，維持該濃度10 d。陽(yáng)性對(duì)照組采用人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞株，空白對(duì)照組采用未經(jīng)處理的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1，實(shí)驗(yàn)對(duì)照細(xì)胞CNE-1應(yīng)用雷公藤作用10 d的細(xì)胞，取各種細(xì)胞各1×106，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，按Bradford法測(cè)定蛋白含量。按試劑盒的要求應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)p27、p16、CDK4和Cyclin D1的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 CNE-1培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞復(fù)蘇后，復(fù)蘇第一代生長(zhǎng)較為緩慢，約為4 d才能鋪滿培養(yǎng)瓶。在傳二代后，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，1∶3傳代，約72 h就能長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈近似球形或多邊形，聚集在一起。在生長(zhǎng)稀疏的部位有的有長(zhǎng)的突起，中間部分也近似球形(圖1)。

2.2 CHA對(duì)CNE-1最佳抑癌濃度的篩選 體外CCK-8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組細(xì)胞相比，CHA作用組細(xì)胞增殖均被不同程度的抑制，CHA的濃度從25 μmol/L開(kāi)始，處理組與未處理的對(duì)照組相比，CNE-1細(xì)胞的增殖率就開(kāi)始明顯下降(P<0.05)，隨著劑量的增大，細(xì)胞增殖率的下降越來(lái)越明顯，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。到100 μmol/L時(shí)，CHA對(duì)CNE-1的作用達(dá)到最大。從200 μmol/L開(kāi)始CHA對(duì)細(xì)胞的抑制作用開(kāi)始減弱(圖2)。100 μmol/L的CHA對(duì)CNE-1的抑制作用與其他各組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 傳代培養(yǎng)70 h的CNE-1細(xì)胞(bar=50 μm)

Fig.1 The subculture of CNE-1 for 70 h (bar=50 μm)

細(xì)胞呈多角形或類圓形，稀疏的部位可見(jiàn)有長(zhǎng)的突起。

圖2 不同濃度的綠原酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的抑制作用

Fig.2 Inhibition on CNE-1 growth induced by different concentration of CHA

與0 μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01；與100 μmol/L 比較，&P<0.05，##P<0.01。

細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線：從CNE-1細(xì)胞株生長(zhǎng)曲線可知，從75 μmol/L到150 μmol/L的各個(gè)濃度，CHA均能有效的抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(F=28.75，P<0.05)，且隨著CHA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)CNE-1的抑制作用也增強(qiáng)，CHA作用到第6天時(shí)，抑制作用達(dá)到最佳，以后維持在較高的水平，呈時(shí)間依賴性(F=202.131，P<0.05，圖3)。再結(jié)合上一個(gè)結(jié)果，CHA從25 μmol/L到500 μmol/L各個(gè)濃度中，對(duì)CNE-1的生長(zhǎng)增殖均有不同程度的抑制作用，但以100 μmol/L的CHA的抑制作用最強(qiáng)。為了篩選更確切的濃度，設(shè)計(jì)并比較了從75到150 μmol/L的CHA對(duì)CNE-1的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他濃度相比，以100 μmol/L在6 d時(shí)抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)。時(shí)間與濃度之間無(wú)交互作用(F=0.733，P=0.768)。通過(guò)增殖率，可以初步判定CHA對(duì)CNE-1的最適抑制濃度為100 μmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇此濃度為實(shí)驗(yàn)濃度。

圖3 綠原酸對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的增長(zhǎng)抑制作用

Fig.3 Inhibition of CHA on CNE-1 growth

2.3 CHA對(duì)CNE-1細(xì)胞株的抑制作用 經(jīng)過(guò)TRAP PCR ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示陰性對(duì)照組的端粒酶活性為0.037，陽(yáng)性對(duì)照組的端粒酶活性為3.126。正常培養(yǎng)的CNE-1細(xì)胞株的端粒酶活性為3.076，而應(yīng)用CHA(100 μmol/L)處理10 d后的CNE-1細(xì)胞株的端粒酶活性為1.621，盡管其仍高于正常細(xì)胞，但與陽(yáng)性對(duì)照組或正常培養(yǎng)CNE-1(0 μmol/L CHA)相比均具有顯著性差異(P<0.01，圖4)。說(shuō)明人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1應(yīng)用100 μmol/L的CHA處理10 d后，能有效的抑制其生長(zhǎng)，但其仍然具有較快的生長(zhǎng)特性。對(duì)于一般的細(xì)胞，端粒酶的活性都小于1.5，可以認(rèn)為是正常范圍。

圖4 端粒酶活性的測(cè)定

Fig.4 Detection of telomerase activity

100 μmol/L CHA作用10 d后，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，**P<0.01；與正常培養(yǎng)的(0 μmol/L)CNE-1相比，##P<0.01。

從Western blot的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，p27蛋白在100 μmol/L的CHA處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中有較明顯的表達(dá)，而在正常培養(yǎng)的CNE-1細(xì)胞中和陽(yáng)性對(duì)照組(人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080)，p27蛋白幾乎檢測(cè)不到(圖5)，偶爾能看到淡淡的條帶，在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中，應(yīng)用雷公藤作用10 d的CNE-1細(xì)胞中，也能看到p27蛋白的表達(dá)(圖5)。說(shuō)明在人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中，抑癌基因p27的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞癌性變，而應(yīng)用100 μmol/L的CHA處理10 d后，p27的蛋白開(kāi)始有較明顯的表達(dá)，說(shuō)明CHA通過(guò)激活抑癌基因p27，從而達(dá)到抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。

圖5 綠原酸對(duì)CNE-1中p27表達(dá)的作用

Fig.5 Effects of CHA on the expression of p27 in CNE-1

泳道1：100 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道2：0 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道3：雷公藤處理CNE-1；泳道4：HT1080。

對(duì)于p27的Western blot的結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，再與β-actin的條帶灰度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p27在CNE-1(100 μmol/L的CHA處理組)中的表達(dá)量明顯高于CNE-1(0 μmol/L的CHA處理組)和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，但與雷公藤組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 p27表達(dá)的相對(duì)灰度值

Tab.1 Relative gray scale value of p27 expression (±s，n=4)

與陽(yáng)性對(duì)照組相比，**P<0.01；與0 μmol/LCHA組相比，##P<0.01。

抑癌基因p16的表達(dá)水平和趨勢(shì)與p27基因相似，在100 μmol/L的CHA處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中有較明顯的表達(dá)，而在正常培養(yǎng)的CNE-1細(xì)胞中和陽(yáng)性對(duì)照組(人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080)，p16蛋白只有少量的表達(dá)，個(gè)別樣品幾乎檢測(cè)不到(圖6)，偶爾能看到淡淡的條帶，在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中，應(yīng)用雷公藤作用10 d的CNE-1細(xì)胞中，也能看到p16蛋白的表達(dá)(圖6)。

圖6 綠原酸對(duì)CNE-1中p16表達(dá)的作用

Fig.6 Effects of CHA on the expression of p16 in CNE-1

泳道1：100 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道2：0 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道3：雷公藤處理CNE-1；泳道4：HT1080。

對(duì)于p16的Western blot的結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，再與β-actin的條帶灰度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16在CNE-1(100 μmol/L的CHA處理組)中的表達(dá)量明顯高于CNE-1(0 μmol/L的CHA處理組)和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，略高于雷公藤處理組，但二者間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 p16表達(dá)的相對(duì)灰度值

Tab.2 Relative gray scale value of p16 expression (±s，n=4)

與陽(yáng)性對(duì)照組相比，**P<0.01；與0 μmol/L的CHA組比，##P<0.01。

應(yīng)用100 μmol/L的CHA處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1，Cyclin D1和CDK4的表達(dá)與對(duì)照組的CNE-1細(xì)胞相比，明顯呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)(圖7、圖8)。說(shuō)明100 μmol/L的CHA對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1具有抑制作用，其機(jī)制是通過(guò)延緩CNE-1細(xì)胞株通過(guò)G1期進(jìn)入S期從而達(dá)到對(duì)CNE-1的生長(zhǎng)抑制作用。

圖7 綠原酸對(duì)CNE-1 中CDK4表達(dá)的抑制作用

Fig.7 CHA’s inhibition on the expression of CDK4 in CNE-1

泳道1：100 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道2：0 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道3：雷公藤處理CNE-1；泳道4：HT1080。

圖8 綠原酸對(duì)CNE-1中Cyclin D1表達(dá)的抑制作用

Fig.8 CHA’s inhibition on the expression of Cyclin D1 in CNE-1

泳道1：100 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道2：0 μmol/L CHA處理CNE-1；泳道3：雷公藤處理CNE-1；泳道4：HT1080。

對(duì)于cyclin D1和CDK4的Western blot的結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，再與β-actin的條帶灰度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cyclin D1和CDK4在CNE-1(100 μmol/L的CHA處理組)中的表達(dá)量明顯低于CNE-1(0 μmol/L的CHA處理組)和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，但與雷公藤處理組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 cyclin D1和CDK4表達(dá)的相對(duì)灰度值的比較

Tab.3 Relative gray value scale of cyclin D1 and CDK4 expressions (±s，n=4)

與陽(yáng)性對(duì)照組相比，**P<0.01；與0 μmol/L的CHA組比，##P<0.01。

3 討 論

中藥金銀花的特征活性成分為CHA，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、升高白細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、降血脂等作用[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道CHA對(duì)肉瘤180及艾氏腹水癌有明顯的細(xì)胞毒作用。本研究采用CCK-8吸收法觀察了CHA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的抑制率，從而進(jìn)行初步篩選CHA的最適抑制濃度。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著CHA濃度的增加(從25 μmol/L到100 μmol/L)，CHA對(duì)CNE-1的抑制作用明顯增強(qiáng)，CHA濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)為最大值，若超過(guò)該值，抑制作用增加不明顯，甚至出現(xiàn)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的抑制作用降低的現(xiàn)象。說(shuō)明一定濃度的CHA對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。之后進(jìn)一步對(duì)CHA的濃度進(jìn)行篩選，通過(guò)繪制CNE-1細(xì)胞株的增殖率(相對(duì)生長(zhǎng)曲線)對(duì)CHA的濃度進(jìn)行精細(xì)篩選，最后確定其最佳的藥物濃度為100 μmol/L。從生長(zhǎng)曲線上，從第1天到第6天，幾個(gè)不同濃度的CHA對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1均具有抑制作用，其中終濃度達(dá)到100 μmol/L的CHA作用后的CNE-1細(xì)胞株，細(xì)胞增殖率最低。由此可以確定100 μmol/L是CHA發(fā)揮其抑制CNE-1細(xì)胞株的最適濃度，此后的實(shí)驗(yàn)均采用這一濃度。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因的表達(dá)下調(diào)，是多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。在肝癌、前列腺癌、子宮癌等組織中，抑癌基因p27[13]、p53[14]、p16[15]等表達(dá)明顯降低。鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中抑癌基因p27和p16的表達(dá)呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)，抑癌基因的表達(dá)受到強(qiáng)烈的抑制，導(dǎo)致癌基因的作用增強(qiáng)，引起正常細(xì)胞的惡性變。在本實(shí)驗(yàn)中，人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1細(xì)胞系應(yīng)用CHA(100 μmol/L)作用10 d后，p27基因和p16基因的表達(dá)量均明顯升高，說(shuō)明CHA發(fā)揮其抑制CNE-1細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的作用與增加抑癌基因的表達(dá)相關(guān)。也有研究表明，Cyclin D1、CDK4表達(dá)上調(diào)的程度與某些腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期素依賴激酶的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1呈高表達(dá)，而CDK4也呈高表達(dá)的趨勢(shì)，說(shuō)明細(xì)胞更加易于通過(guò)細(xì)胞周期的關(guān)卡，細(xì)胞增殖周期縮短，呈現(xiàn)出細(xì)胞癌性變的特性。在應(yīng)用CHA(100 μmol/L)作用10d后，無(wú)論是cyclin D1還是CDK4均有明顯的下降，說(shuō)明一定濃度的CHA(100 μmol/L)能顯著的降低細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，抑制CNE-1細(xì)胞快速的通過(guò)細(xì)胞關(guān)卡，達(dá)到抑制CNE-1增殖的作用。

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(編輯 韓維棟)

Effects of chlorogenic acid on cultured human nasopharyngealcarcinoma cell line CNE-1invitro

YAOSu-yan1,LIQuan-sheng2,ZHENGDe-yu3

(1.DepartmentofPathophysiology,Jinzhou121001; 2.DepartmentofOtorhinolaryngology,PanjinCentralHospital,Panjin124000;3.DepartmentofAnatomy,LiaoningMedicalCollege,Jinzhou121001,China)

Objective To explore the effects and mechanisms of chlorogenic acid (CHA) on the human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 culturedinvitro. Methods The human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 underwent resuscitation in sterile conditions. CHA was added into the CNE-1 culture media at the concentrations of 0, 25, 50, 100, 200 and 500 μmol/L for 7 days. The optimal concentration of CHA which inhibited the CNE-1 was determined by CCK8 inhibition experimentinvitro. After CNE-1 was cultured at the optimal concentration of CHA for 10 days, telomerase activation was detected by ELISA method. The expressions of anti-oncogene p27 and p16 as well as cyclin D1 and CDK4 were determined by Western blot. Results The optimal concentration of CHA for inhibiting CNE-1 cell line was 100 μmol/L determined by CCK8 inhibition experiment. Telomerase activation of CNE-1 was decreased to 1.621 after CNE-1 was treated with 100 μmol/L CHA for 10 days. The activation was significantly lower than that in the positive group and the normal cultured CNE-1 group (P<0.01). Anti-oncogene p27 and p16 were expressed in a low quantity after CNE-1 was treated with 100 μmol/L CHA for 10 days. But there was hardly any p27 or p16 expression in the positive group (HT1080) and the normal cultured CNE-1 group (CHA concentration being 0 μmol/L) determined by Western blot method. The expressions of cyclin D1 and cyclin dependence kinase 4 (CDK4) were lower after CNE-1

100 μmol/L CHA for 10 days than those in the HT1080 cell line and the normal cultured CNE-1 (CHA concentration being 0 μmol/L). Conclusion CHA has the functions of decreasing telomerase activation of CNE-1 cell line, increasing the anti-oncogene expression and decreasing cyclin D1 expression. The inhibitory function of CHA on CNE-1 cell line is realized by activating the expression of anti-oncogene and inhibiting the expression of cyclin D1.

chlorogenic acid; nasopharyngeal carcinoma; anti-oncogene; cyclin D; telomerase; p27; p16

2014-01-25

2014-05-10

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013022066，2013022048) Supported by the Natural Science Foundation of Liaoning Province (No.2013022066 and 2013022048)

鄭德宇，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)退行性疾病的實(shí)驗(yàn)治療方面的研究. E-mail: Zdy4673349@163.com

姚素艷(1971-)，碩士，主要從事阿爾茨海默病的實(shí)驗(yàn)治療和中藥金銀花提取物綠原酸的藥理作用的研究. E-mail: ysyzdy@163.com

時(shí)間：2014-06-04 15∶01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140922.0828.002.html

R766.3

A

10.7652/jdyxb201406022