楊樹農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素濃度的篩選

馮連榮 張興芬 尹 杰 宋立志 趙繼梅 彭儒勝 矯麗曼 張 妍

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

楊樹農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素濃度的篩選

馮連榮 張興芬 尹 杰 宋立志 趙繼梅 彭儒勝 矯麗曼 張 妍

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

研究頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢拉啶、頭孢他啶4種頭孢類抗生素對根癌農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105的抑制作用；以歐美楊111和蓋楊組培苗為材料，研究卡那霉素(Km)對2種楊樹葉片分化及莖段生根的影響，并分析頭孢噻肟鈉對歐美楊111葉片分化及莖段生根的影響。結(jié)果表明，頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉和頭孢他啶對LBA4404具有良好的抑菌效果，使用濃度為50 mg/L，其中頭孢噻肟鈉對農(nóng)桿菌EHA105的抑菌效果最好，頭孢拉啶抑菌效果較差。不同楊樹品種對卡那霉素的耐受性差異不大，歐美楊111在葉片轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)時，使用濃度為10 mg/L，抗性芽生根階段為20 mg/L；蓋楊在葉片轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)時，卡那霉素使用濃度為20 mg/L，抗性芽生根階段為 25 mg/L，頭孢噻肟鈉對歐美楊111葉片分化和莖段生根影響不大。

楊樹；抗生素；根癌農(nóng)桿菌；抑菌效果；遺傳

目前楊樹(Populusspp.)遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、PEG(聚乙二醇)法、電激法和基因槍法等[1-2]，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因其轉(zhuǎn)化方法簡單、效率高等特點已成為楊樹主要的遺傳轉(zhuǎn)化方式[3]。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化過程中，使用抑菌抗生素能及時有效地抑制或殺死農(nóng)桿菌的生長，以防止其危害植株組織并影響植株再生[4]。同時需要利用植物表達載體上所攜帶的抗性標(biāo)記基因，使用抗生素篩選被轉(zhuǎn)化細胞。因此，開展不同抗生素對農(nóng)桿菌的抑菌效果試驗以及外植體對抗生素的敏感性試驗是成功建立楊樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的前提條件。

本研究在建立歐美楊(P.×euramericana)111和蓋楊(P.×gaixianensis)葉片再生植株優(yōu)化體系的基礎(chǔ)上，分析了4種頭孢類抑菌抗生素對根癌農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105的抑菌效果，以及抗生素對組培葉片不定芽分化及組培苗生根的影響。以確定適合歐美楊111和蓋楊的抑菌抗生素種類和濃度及選擇抗生素濃度，為開展根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的歐美楊111和蓋楊遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗植物材料與菌株

植物材料為歐美楊111和蓋楊組培苗；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為LBA4404和EHA105，質(zhì)粒為rd29A+pROKⅡ+VaCBF3，抗性標(biāo)記基因為卡那霉素(Kanr)。

1.2 試劑

4種國產(chǎn)醫(yī)用頭孢類抗生素，其中頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢他啶為悅康藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)；頭孢拉啶為上海新先鋒藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；卡那霉素購自Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

歐美楊111葉片分化培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂 6 g/L；蓋楊葉片分化培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂6 g/L；歐美楊111生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 0.4 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6 g/L；蓋楊生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6 g/L；農(nóng)桿菌培養(yǎng)采用LB固體和液體培養(yǎng)基。

1.4 試驗方法

1.4.1 頭孢類抗生素對農(nóng)桿菌的抑制試驗 抗生素濃度設(shè)置為：0(CK)、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L。挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取0.5 mL菌液接種至50 mL的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.5時吸取60 μL菌液滴于加有抗生素的LB平板上，用涂布棒均勻涂抹至菌液被充分吸收，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后觀察農(nóng)桿菌生長情況。

1.4.2 不同濃度卡那霉素下歐美楊111和蓋楊葉片分化狀況 選取顏色正常、充分展葉的歐美楊111和蓋楊無菌苗葉片，沿主脈剪1～2刀，接種至含有卡那霉素的分化培養(yǎng)基中，卡那霉素濃度設(shè)置為0(CK)、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，每周更換1次培養(yǎng)基，3周后觀察葉片分化情況。

1.4.3 不同濃度卡那霉素下歐美楊111和蓋楊莖段生根狀況 選取生長較一致且健壯的歐美楊111和蓋楊莖段，切成長度為2～3 cm，將莖段移入附加不同濃度的卡那霉素的生根培養(yǎng)基中，卡那霉素濃度設(shè)置為0 (CK)、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，觀察莖段生根及生長狀況。

1.4.4 不同濃度頭孢噻肟鈉下歐美楊111葉片分化及莖段生根狀況 頭孢噻肟鈉濃度設(shè)置為0(CK)、50、100、200、400、600、800 mg/L。選取顏色正常、充分展葉的歐美楊111無菌苗葉片，沿主脈剪1～2刀，接種至含有頭孢噻肟鈉的分化培養(yǎng)基中，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，每周更換1次培養(yǎng)基，3周后觀察葉片分化情況。選取生長較一致且健壯的歐美楊111莖段，切成長度為2～3 cm，將莖段移入加有不同濃度的頭孢噻肟鈉生根培養(yǎng)基中，每個濃度處理設(shè)3個重復(fù)，觀察莖段生根及生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭孢類抗生素對農(nóng)桿菌的抑制作用

4種頭孢類抗生素對農(nóng)桿菌不同菌株的抑制試驗結(jié)果見表1。

由表1可知：4種抗生素對農(nóng)桿菌LBA4404抑制作用差別不大，頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉和頭孢他啶在濃度為50 mg/L時可以抑制其生長，而頭孢拉啶在濃度為100 mg/L時也可以完全抑制其生長。4種抗生素對農(nóng)桿菌EHA105的抑制作用差異明顯，其中頭孢噻肟鈉對其抑制效果最好，在50 mg/L時即可完全抑制EHA105的生長；頭孢曲松鈉和頭孢他啶對農(nóng)桿菌EHA105的抑制效果差別不大，濃度分別為300 mg/L和350 mg/L時可以完全抑制其生長，而頭孢拉啶在濃度為500 mg/L時尚不能完全抑制農(nóng)桿菌生長，仍有大量菌落長出。所以結(jié)合4種抗生素的抑菌效果來看，可以選擇頭孢噻肟鈉作為農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105的抑菌劑，使用濃度為50 mg/L。

表1 頭孢類抗生素對農(nóng)桿菌的抑制試驗結(jié)果

注：+++代表農(nóng)桿菌成片，分不出單菌落；++代表單菌落數(shù)量較多，少數(shù)成片；+代表單菌落數(shù)量較少，零星分布；-代表未見單菌落出現(xiàn)。

2.2 卡那霉素對2種楊樹葉片分化的影響

卡那霉素對歐美楊111和蓋楊葉片分化具有明顯的抑制作用，均表現(xiàn)出隨濃度增加抑制作用增強的趨勢，結(jié)果見表2。歐美楊111葉片對卡那霉素比較敏感，在卡那霉素濃度為10 mg/L時葉片褪綠發(fā)黃，未見膨大，葉片分化能力完全被抑制。蓋楊葉片對卡那霉素也比較敏感，在卡那霉素15 mg/L時蓋楊葉片發(fā)黃且部分出現(xiàn)干枯，分化率僅為26.7%，而在卡那霉素濃度為20 mg/L時則完全抑制葉片分化。因此，利用歐美楊111作為轉(zhuǎn)化受體材料時，葉片分化時卡那霉素使用濃度為10 mg/L；利用蓋楊作為轉(zhuǎn)化受體材料時，葉片分化時卡那霉素使用濃度為20 mg/L。

表2 不同濃度卡那霉素下2種楊樹葉片的分化狀況

2.3 卡那霉素對2種楊樹莖段生根的影響

卡那霉素對歐美楊111和蓋楊莖段生根具有較明顯的抑制作用，表現(xiàn)出隨濃度增加抑制作用增強的趨勢，結(jié)果見表3。對照組歐美楊111莖段全部生根，生根率為100%，且主根長數(shù)量多，有須根；當(dāng)卡那霉素濃度為15 mg/L時生根率明顯下降為12.5%，組培苗長勢不好，葉褪綠；濃度為20 mg/L時莖段基部稍膨大，不能生根。蓋楊在卡那霉素濃度為20 mg/L時生根率明顯下降為8.3%，組培苗長勢不好，葉褪綠；25 mg/L時莖段基部稍膨大，不能生根，且組培苗長勢漸差，葉片發(fā)黃。因此，以歐美楊111作為轉(zhuǎn)化受體材料時，莖段生根時卡那霉素的使用濃度為20 mg/L；以蓋楊作為轉(zhuǎn)化受體材料時，莖段生根時卡那霉素的使用濃度為25 mg/L。

表3 不同濃度卡那霉素下2種楊樹莖段的生根狀況

2.4 頭孢噻肟鈉對歐美楊111葉片分化及莖段生根的影響

頭孢噻肟鈉對歐美楊111葉片分化和莖段生根有一定的影響，結(jié)果見表4。在設(shè)置的頭孢噻肟鈉各個濃度下歐美楊111均可分化，在50 mg/L時葉片分化率可達100%，分化芽多；隨著濃度的增加，葉片分化率有所下降，在濃度為800 mg/L時，分化率為11.1%，葉片分化芽少。歐美楊111莖段在頭孢噻肟鈉各個濃度下，均可生根，在濃度為50 mg/L時生根率達100%，生出主根長、粗壯，且須根多；隨著濃度的增加，生根率有所下降，在濃度為800 mg/L時生根率僅為33.3%，生出主根短，須根少。結(jié)合農(nóng)桿菌對頭孢噻肟鈉的敏感性試驗，選擇頭孢噻肟鈉作為農(nóng)桿菌的抑菌劑，使用濃度為50 mg/L是可以的。

表4 不同濃度頭孢噻肟鈉下歐美楊111葉片分化及莖段生根狀況

3 結(jié)論與討論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因遺傳轉(zhuǎn)化過程中一般需要經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、脫菌選擇培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因植株再生等多個環(huán)節(jié)，在共培養(yǎng)結(jié)束后，需要用抗生素及時有效地抑制或殺死農(nóng)桿菌的生長，并利用抗性篩選基因在合適的選擇壓下篩選轉(zhuǎn)化細胞[5]。

目前，進行楊樹遺傳轉(zhuǎn)化常用的抑菌抗生素主要為頭孢類抗生素[6]。本試驗通過對4種頭孢類抗生素對根癌農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105的抑菌作用分析顯示：不同菌株的農(nóng)桿菌對頭孢類抗生素敏感性不同，農(nóng)桿菌LBA4404較農(nóng)桿菌EHA105對頭孢類抗生素更為敏感，低抗生素含量時(50～100 mg/L)即可完全抑制其生長。農(nóng)桿菌EHA105對4種抗生素的敏感性不同，其中頭孢噻肟鈉對EHA105抑制作用最強，在濃度為50 mg/L時可完全抑制其生長，而頭孢拉啶濃度為500 mg/L時，農(nóng)桿菌仍可大量生長。4種抗生素對農(nóng)桿菌EHA105抑菌效果為：頭孢噻肟鈉>頭孢曲松鈉>頭孢他啶>頭孢拉啶，因此可選擇頭孢噻肟鈉作為農(nóng)桿菌的抑菌劑。

卡那霉素是植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的抗生素[7-8]，本試驗使用目的基因質(zhì)粒具有卡那霉素抗性標(biāo)記基因，所以選擇卡那霉素作為選擇抗生素。不同楊樹品種卡那霉素使用濃度不盡相同，小黑楊(P.simonii×P.nigra)、歐美楊的敏感性試驗中卡那霉素使用濃度分別為40 mg/L和30 mg/L[6,9]。本研究中，歐美楊111和蓋楊對卡那霉素的敏感性不同，但差異不大。試驗確定歐美楊111和蓋楊在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，選擇培養(yǎng)各階段卡那霉素使用濃度為：歐美楊111葉片轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)時使用濃度為10 mg/L，抗性芽生根階段使用濃度為20 mg/L；蓋楊在葉片轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)時使用濃度為20 mg/L，抗性芽生根階段使用濃度為25 mg/L。

選擇農(nóng)桿菌抑菌劑時要考慮其對植物葉片分化及莖段生根的影響。有試驗表明，頭孢噻肟鈉對歐美楊108、山楊(P.dovidiana)和山新楊(P.davidiana×P.bollena)等葉片分化及莖段生根影響不大[10-12]。本試驗分析了頭孢噻肟鈉對歐美楊111葉片分化及莖段生根的影響。試驗表明，其對歐美楊111葉片分化及莖段生根影響不大，在濃度為800 mg/L時葉片仍可分化，莖段仍可生根。所以選擇頭孢噻肟鈉作為農(nóng)桿菌抑菌劑，使用濃度可選擇50 mg/L。

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(責(zé)任編輯 張 坤)

Study on Screening the Concentration of Antibiotics ofAgrobacteriumtumefaciensMediated Transformation inPopulus

FENG Lian-rong, ZHANG Xing-fen, YIN Jie, SONG Li-zhi, ZHAO Ji-mei,PENG Ru-Sheng, JIAO Li-man, ZHANG Yan

(Liaoning Provincial Institute of Poplar, Gaizhou Liaoning 115200, China)

The inhibitory effects of four antibiotics (Cefotaxime Sodium, Ceftriaxone Sodium, Cefradine, Ceftazidime) onAgrobacteriumtumefaciensLBA4404 and EHA105 were analyzed. The tissue culture plantlets ofP.×euramericanaandP.×gaixianensiswere chosen as the materials to study the effects of kanamycin on leaf differentiation and stem rhizogenesis ofP.×euramericanaandP.×gaixianensis. Besides, the effects of Cefotaxime Sodium on leaf differentiation and stem rhizogenesis ofP.×euramericanaalso was analyzed. The result showed that Cefotaxime Sodium, Ceftriaxone Sodium, Ceftazidime had antibacterial effect onAgrobacteriumtumefactionsLBA4404, and the working concentration was 50 mg/L. Among them, the antibacterial effect of Cefotaxime Sodium was the best forAgrobacteriumtumefactionsEHA105, and the effect of Cefotaxime Sodium was the worse. The tolerance of differentPopuluson kanamycin was similar. ForP.×euramericana, the 10 mg/L concentration of kanamycin was ideal to screen leaf differentiation culture, while the concentration was 20 mg/L in rooting-stage. The concentration of kanamycin was 20 mg/L when leaf differentiation culture ofP.×gaixianensiswas screened, and the concentration was 25 mg/L in rooting-stage. ForP.×euramericana, the effect of Cefotaxime Sodium on the leaf differentiation and stem rhizogenesis was small.

Populus; antibiotics;Agrobacteriumtumefactions; inhibiting effect; genetic

2013-11-27

遼寧省科學(xué)公益事業(yè)研究基金項目(2011005007)資助；國家林業(yè)局林業(yè)行業(yè)公益性科研專項(200904040)資助。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.04.006

S792.119

A

2095-1914(2014)04-0031-05

第1作者：馮連榮(1983—)，女，碩士，工程師。研究方向：楊樹轉(zhuǎn)基因育種及病蟲害防治。Email：fenglianrong@163.com。