拮抗農(nóng)業(yè)致病真菌放線菌菌株CTF619—D的分離、篩選及初步鑒定

康敬芹　呂躍東　王勇　劉楊　張良

摘要：從黃河中分離篩選出若干放線菌菌株，并對放線菌菌株進行分離純化，采用瓊脂塊法進行初篩，用紙片擴散法和生長速率法對抑菌效果較好的菌株進行抑菌活性復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)菌株CTF619-D的發(fā)酵產(chǎn)物對番茄炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、蘋果腐爛病菌等10多種真菌均有不同程度的抑制作用，其中對番茄炭疽病菌的抑菌圈最大能達到2.8 cm。通過對CTF619-D菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析等方面的研究發(fā)現(xiàn)，CTF619-D菌株與淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）FSHJ9菌株的序列同源性達100%，但在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性方面與其存在差異，因此初步確定CTF619-D為淡紫灰鏈霉菌的一個新變種。

關(guān)鍵詞：放線菌；拮抗；生理生化；16S rDNA

中圖分類號：S182文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0086-04

收稿日期：2013-06-06

基金項目：遼寧省教育廳項目（編號：2009A374）。

作者簡介：康敬芹（1987—），女，山東樂陵人，碩士研究生，研究方向為生物制藥及劑型加工與應(yīng)用。E-mail：xiaokang586@126.com。

通信作者：呂躍東，副教授，主要從事生物制藥及劑型加工與應(yīng)用研究。E-mail：lyd9900@163.com。放線菌是一類具有廣泛實際用途和巨大經(jīng)濟價值的微生物資源。它突出的特性之一是能產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素，是生產(chǎn)抗生素的主要菌群，是研制新醫(yī)藥、新農(nóng)藥和生物防治活菌劑的源頭[1]。據(jù)估計，在全世界發(fā)現(xiàn)的8 000多種生物活性物質(zhì)中，近70%是由放線菌產(chǎn)生的[2]。因此，為了達到高效、環(huán)保的生物防治目的，篩選和利用拮抗放線菌已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的熱點之一。在新抗生素的篩選分離過程中，從黃河土壤中分離出了1株具有較強活性的放線菌菌株CTF619-D，該菌株對多種植物農(nóng)業(yè)病原真菌具有較強的抑制作用。本研究主要對該菌株的形態(tài)特性、培養(yǎng)特征、生理生化特征、16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析等方面進行分析，以確定其分類地位，并對活性成分的抗菌譜進行初步研究，旨在發(fā)現(xiàn)新的抗生素或原有抗生素新的防治特性，為豐富防治水果蔬菜病菌的生物農(nóng)藥種類提供實踐經(jīng)驗和理論依據(jù)，為農(nóng)用抗生素的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試放線菌放線菌由采自黃河的不同水樣和土樣中分離得到。

1.1.2供試病原菌以下病原菌均由遼寧科技大學(xué)生物工程系生物制藥工藝室提?。海?）香蕉灰紋病菌（Cordana musae）；（2）油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；（3）黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）；（4）番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）；（5）辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）；（6）黃瓜黑星菌（Cladosporium cucumerinum）；（7）番茄葉霉病菌（Fulvia fulva）；（8）水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）；（9）番茄炭疽病菌（Colletotrichum lycopersici）；（10）稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）；（11）小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）；（12）棉花黃萎病菌（Fusarium oxysporum）；（13）小麥根腐霉病菌（Helminthosporium sorokinianum）；（14）蘋果腐爛病菌（Cytospora sp.）；（15）黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）；（16）水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）；（17）小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）；（18）稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）；（19）黃瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）；（20）姜瘟病菌（Pseudomonas solanacearum）。

1.1.3培養(yǎng)基分離所用培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基+重鉻酸鉀[3-5]（0.6×10-6～0.7×10-6 g/L），pH值為7.4；放線菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：高氏一號瓊脂培養(yǎng)基；病原菌培養(yǎng)及拮抗試驗所用培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；鑒定所用培養(yǎng)基參照《放線菌：屬和種的分類、鑒定和描述》[6]。

1.1.4主要儀器與設(shè)備LRH-250A型生化培養(yǎng)箱，TGL-16C型高速離心機，ZHWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器，Autoelavo ES-315型高壓滅菌鍋，T-203型電子天平，SW-CJ-5 型超凈工作臺，Motic BA400型數(shù)碼成像光學(xué)顯微鏡，JSM-6360LV型電子掃描顯微鏡，TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600型PCR擴增儀，Mupid型核酸電泳儀，Image Master VDS電泳成像裝置，EPS300型蛋白質(zhì)電泳儀，ABI PRISMTM 3730XL DNA Sequencer型DNA測序儀。測序用試劑：BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit 試劑盒；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒。

1.2方法

1.2.1放線菌的分離和純化將土壤自然風(fēng)干，在28 ℃條件下放置5～7 d，用研缽磨細以重鉻酸鉀[3-5]（0.6×10-6～0.7×10-6 g/L）為抑菌劑，采用稀釋涂布法對土壤中的放線菌進行分離，然后置于28 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)7～10 d，觀察放線菌的生長情況，根據(jù)菌落形態(tài)選取不同菌株，經(jīng)純化后將單菌落轉(zhuǎn)接到高氏一號斜面培養(yǎng)基上編號培養(yǎng)14 d，然后于4 ℃保藏。

1.2.2菌株的初篩采用固體平板發(fā)酵培養(yǎng)的方法篩選[7]，即高氏一號培養(yǎng)放線菌7～10 d，將長好的放線菌打孔后反向放置于接種了農(nóng)業(yè)治病真菌的平板中央，在25 ℃條件真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后觀察測量抑菌圈。試驗過程均設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3菌株的復(fù)篩采用濾紙片法[8]測定發(fā)酵濾液對植物病原菌的拮抗性。將初篩所得放線菌菌株在28 ℃、150 r/min 條件下液體振蕩培養(yǎng)7 d，將培養(yǎng)液4 000 r/min無菌離心10 min。將無菌濾紙片在離心所得上清液中浸泡 3 min 后置于接種農(nóng)業(yè)致病真菌的PDA平板中央，于25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)72 h后，再分別測量抑菌圈直徑。對照為浸無菌水的濾紙片。試驗設(shè)3個重復(fù)。最終確定抑菌活性明顯的菌株作為目的生防菌。

1.2.4放線菌鑒定通過觀察菌株CTF619-D的菌絲形態(tài)、孢子和孢子絲形狀、菌株在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征以及一系列的生理生化特征，按照《鏈霉菌鑒定手冊》[9]對菌株CTF619-D進行初步的分類鑒定。

（1）形態(tài)特征。將菌株CTF619-D接種于高氏一號培養(yǎng)基上，在28 ℃下插片培養(yǎng)7～10 d后，分別用光學(xué)顯微鏡和電子掃描顯微鏡觀察插片上的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲和孢子的形態(tài)特征。

（2）培養(yǎng)特征。將菌株CTF619-D分別接種在不同的培養(yǎng)基上（Ⅰ.高氏一號合成培養(yǎng)基，Ⅱ.葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基，Ⅲ.PDA培養(yǎng)基，Ⅳ.伊莫松培養(yǎng)基，Ⅴ.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，Ⅵ.無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基，Ⅶ.高氏一號培養(yǎng)基，Ⅷ.馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基，Ⅸ.蔗糖察氏培養(yǎng)基），置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在10、20 d觀察培養(yǎng)基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、可溶性色素的顏色及表觀特征。

（3）生理生化指標(biāo)。參照《鏈霉菌鑒定手冊》對菌株CTF619-D進行以下生理生化試驗：Ⅰ.明膠液化試驗，Ⅱ.淀粉水解試驗，Ⅲ.牛奶凝固與胨化，Ⅳ.硝酸鹽還原反應(yīng)，Ⅴ.纖維素分解試驗，Ⅵ.產(chǎn)生硫化氫試驗，Ⅶ.產(chǎn)生黑色素試驗，Ⅷ.碳源的利用試驗等，檢測觀察菌株的生理生化指標(biāo)[10]。

（4）16S rDNA測序及序列分析。在80 ℃下挑取用試管培養(yǎng)的CTF619-D新鮮菌體變性15 min，然后離心取上清液作為模板進行PCR擴增。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳，使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒切膠回收目的片段后，經(jīng)大連寶生物（工程）有限公司完成DNA測序。用微波法[11]提取總DNA，以Seq Forward、Seq Internal、Seq Reverse為引物進行DNA測序，采用正向引物（27 f）5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′、反向引物（1 492 f）5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′將測得的基因序列復(fù)制到Blast程序中，與GenBank中核苷酸數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行對比分析，然后選取與試驗菌株序列相似度較高的菌株，利用DNAstar軟件對目標(biāo)序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，并對所構(gòu)建的進化樹進行評估[12]，確定所測菌株的分類地位[13]。

2結(jié)果與分析

2.1活性菌株的分離和篩選

對20多株放線菌進行抑菌活性的初篩，大多數(shù)菌株抑菌活性很低，但CTF619-D對多數(shù)植物病原真菌有抑制效果，其中對黃瓜炭疽病菌和番茄炭疽病菌抑制效果很好（圖1、表1）。

2.2放線菌CTF619-D菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)特征觀察 拮抗放線菌CTF619-D菌株在高氏一號培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7～10 d后，可形成基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，在電子顯微鏡下觀察，放線菌CTF619-D基內(nèi)菌絲不斷裂，無橫隔，成分枝狀；氣生菌絲發(fā)達，成熟后發(fā)育成孢子

2.2.2培養(yǎng)特征觀察菌株在不同的培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同的生長情況，并形成豐富的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲（表2）。

2.2.3生理生化特性菌株革蘭氏染色呈陽性，生長溫度范圍為5～40 ℃，最適溫度為28 ℃，生長pH值范圍為5～10，最適pH值為7.0。菌株CTF619-D可使明膠緩慢液化；能夠水解淀粉；使牛奶不凝固，但胨化；不能水解纖維素；硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性；能夠產(chǎn)生H2S、黑色素；能利用甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、D-木糖、果糖、肌醇、乳糖、鼠李糖等（表3）。

3結(jié)論

本試驗主要通過稀釋分離的方法從采集的土壤中得到若干放線菌，進而用20種農(nóng)業(yè)致病真菌對其進行初篩和復(fù)篩，選出抑菌效果好的放線菌CTF619-D，對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，并采用抑制菌絲生長速率法對抗菌物質(zhì)進行抗菌活性測定，結(jié)果表明，CTF619-D對番茄炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌有較好的抑菌效果，其中對番茄炭疽病菌的抑菌圈直徑最大能達到2.8 cm。通過形態(tài)學(xué)鑒定、培養(yǎng)特征觀察、生理生化指標(biāo)測定、16s rDAN序列的測定及系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果表明，CTF619-D菌株與淡紫灰鏈霉菌FSHJ9聚為一支，序列同源性達到100%，但其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性方面又存在著明顯的區(qū)別，因此可初步確定CTF619-D為淡紫灰鏈霉菌的一個新變種，命名為淡紫灰鏈霉菌黃河變種。另外

該菌株是否能看作是農(nóng)用抗生素的一個新來源，還需要后續(xù)試驗來進一步驗證。

據(jù)報道，在植物病害生物防治中，拮抗微生物主要是鏈霉菌屬及其相關(guān)類群[14]，淡紫灰鏈霉菌是一類重要的抗生素產(chǎn)生菌，它產(chǎn)生的醫(yī)用抗生素（如薰衣草菌素、鏈絲菌素）和農(nóng)用抗生素（如中生菌素等）都已有廣泛的用途[15]。目前，國內(nèi)關(guān)于拮抗淡紫灰鏈霉菌鑒定的諸多研究中，除產(chǎn)生中生菌素的淡紫灰鏈霉菌海南變種外，未見有其他淡紫灰鏈霉菌變種的報道。因此CTF619-D是一株有價值的具生物活性的生防菌株，該菌株有效活性成分分離鑒定及其抑菌機理均有待進一步研究，以期開發(fā)在瓜果蔬菜病害防治領(lǐng)域中具有應(yīng)用前景的抗菌物質(zhì)。

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