MAPK調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長的分子機(jī)制

高華健+任靜+蔡鳳香+李偉+李晶+隋亞平+趙鳳云

摘要：以水稻品種中花 11 號(hào)為材料，利用 MAPKK 抑制劑 PD（PD 98059）分析了 MAPK 信號(hào)對(duì)水稻根系生長、H2O2 產(chǎn)生、生長素積累分布及生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果表明，PD 處理促進(jìn)了初生根和不定根的伸長生長，但抑制了側(cè)根的形成和發(fā)育，并誘導(dǎo)了H2O2 的產(chǎn)生和生長素的積累增加。分子水平分析顯示，PD 處理分別使 14 個(gè)生長素基因和12 個(gè)細(xì)胞周期基因表達(dá)上調(diào)，使 3 個(gè)生長素基因和 7 個(gè)細(xì)胞周期基因表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果說明在正常條件下，MAPK 對(duì)水稻幼苗根系生長的調(diào)節(jié)與其控制 H2O2 產(chǎn)生和生長素平衡及調(diào)控生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）；生長素；水稻根系

中圖分類號(hào)： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0018-04

收稿日期：2013-04-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30671126）；山東省淄博市科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：109036、111089）。

作者簡介：高華?。?992—），男，山東日照人，本科生；任靜（1990—），女，山東鄒平人，碩士研究生，從事植物逆境分子生物學(xué)研究。他們對(duì)本工作的貢獻(xiàn)相同。

通信作者：趙鳳云，教授，從事植物逆境分子生物學(xué)研究。E-mail：zfy1226@126.com。MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)是植物體內(nèi)的重要信號(hào)分子[1]，越來越多的證據(jù)表明 MAPK 信號(hào)在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、激素生理及環(huán)境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[2]。生長素是植物體內(nèi)的關(guān)鍵激素之一，影響植物根系生長、細(xì)胞分裂及基因表達(dá)。關(guān)于生長素與 MAPK 的關(guān)系有不同的報(bào)道[3-4]，如 Mockaitis等報(bào)道生長素誘導(dǎo)擬南芥根系 MAPK 活性增加[5]，Mizoguchi 等試驗(yàn)也得到類似結(jié)果[6]。相反，Kovtun 等研究表明 NPK1（a specific plant MAPK kinase kinase，MAPKKK）激活 MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)，抑制早期生長素應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄[7]，Lee 等和 Dai 等分別報(bào)道 MPK12 和 MKK7 是生長素信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子[8-9]。這些研究表明在生長素信號(hào)傳導(dǎo)過程中存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控 MAPK 途徑[4]。

細(xì)胞周期是控制植物生長的關(guān)鍵因子之一。MAPK 在細(xì)胞分裂過程中起核心作用[4]。如煙草NTF6（Nicotiana tabacum MAPK homolog）在細(xì)胞分裂晚后期被激活并瞬時(shí)定位在成膜體[10]。NTF4（N. tabacum MAPK homolog）在細(xì)胞周期的G1期表達(dá)低，但在S、G2期表達(dá)高[4]。Ma等報(bào)道在胞質(zhì)分裂過程中MAPK磷酸化與細(xì)胞板形成有關(guān)[11]。細(xì)胞周期進(jìn)程受細(xì)胞周期蛋白和（Cycs）和依賴于周期蛋白激酶（CDKs）等一系列蛋白調(diào)控[12]。ROS是植物體內(nèi)的重要信號(hào)分子，有研究表明，MAPK信號(hào)途徑不僅受ROS誘導(dǎo)，還調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生[13-14]。這些結(jié)果顯示MAPK與生長素、細(xì)胞周期和 ROS 有密切關(guān)系，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)生長素、細(xì)胞周期和 ROS 都參與了水稻根系生長的調(diào)節(jié)[15]，但是在水稻幼苗根系生長發(fā)育過程中 MAPK 與它們的關(guān)系還不清楚。本試驗(yàn)以水稻品種中花11號(hào)為材料，利用 MAPKK 抑制劑 PD（PD 98059）研究 MAPK 信號(hào)對(duì)水稻根系生長、H2O2 產(chǎn)生、生長素積累分布及生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的影響。1材料與方法

1.1材料與處理

以水稻中花 11 號(hào)為材料，挑選籽粒飽滿的種子去殼后消毒：75% 乙醇（30 s）、0.1% 氯化汞（15 min）、2% 次氯酸鈉（20 min），無菌水沖洗 6 次以上，然后將種子分別種在MS 培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)[光周期為 14 h光照，光照強(qiáng)度為 200 μmol/（m2·s），白天溫度 26 ℃，夜間10 h溫度為20 ℃，空氣相對(duì)濕度為 50%～60%]培養(yǎng)8 d，然后轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液添加15 μmol/L PD（PD 98059，MAPKK 抑制劑）處理 5 d，每種處理至少重復(fù)3次，每次3個(gè)平行試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn) 50～60 株。

1.2根系生長統(tǒng)計(jì)

初生根和不定根的長度用尺子測(cè)量，初生根和不定根上側(cè)根的數(shù)量和長度用帶數(shù)碼相機(jī)的顯微鏡統(tǒng)計(jì)和測(cè)量，每個(gè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)60株。

1. 3H2O2 含量的測(cè)定

H2O2的定性和定量測(cè)定分別參照Chen等[16]及Loreto等[17]方法進(jìn)行，每種處理至少用20株。

1.4生長素分布和積累的測(cè)定

利用轉(zhuǎn)DR5-GUS 基因水稻對(duì)生長素的分布和積累進(jìn)行測(cè)定，方法參照Petersson 等[18]。轉(zhuǎn)基因水稻種子在MS 培養(yǎng)基萌發(fā)生長8 d，然后轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液添加15 μmol/L PD在上述同樣條件下分別處理5、10 h，或在Hoagland營養(yǎng)液同時(shí)添加0.06% H2O2 和15 mmol/L DMTU（H2O2 清除劑）處理5 h，每種處理至少用20株進(jìn)行GUS 活性檢測(cè)。

1.5RT-PCR 分析

使用 Trizol 試劑提取總 mRNA，取1 μg 總 mRNA，利用RNA PCR Kit（AMV）V3.0合成cDNA。每個(gè)處理PCR反應(yīng)用等量的 cDNA，每個(gè)泳道用25 μL PCR 產(chǎn)物，每個(gè)PCR反應(yīng)在同樣條件下獨(dú)立重復(fù)3次。Osactin1 基因作為內(nèi)標(biāo)，通過Gel-Pro Analyzer 軟件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行半定量，將對(duì)照的轉(zhuǎn)錄水平設(shè)置為1，基因表達(dá)水平≥1.3為表達(dá)上調(diào)，≤0.7為表達(dá)下調(diào)。

1. 6數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的處理。取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。用單因子方差分析PD處理與對(duì)照之間的差異，P<0.05 表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1MAPK對(duì)水稻幼苗根系生長的影響

由圖1-A，B可見，與對(duì)照相比，PD處理促進(jìn)了初生根和不定根的伸長生長（P<0.05）。相反，該處理?xiàng)l件下側(cè)根的形成和生長受到抑制（P<0.05）（圖1-C、D）。說明在正常條件下MAPK 對(duì)水稻根系特別是側(cè)根的生長和發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用。

2.2MAPK對(duì)水稻幼苗根系H2O2含量的影響

MAPK對(duì)H2O2的產(chǎn)生有調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步了解MAPK對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)是否與H2O2產(chǎn)生有關(guān)，定性和定量測(cè)定了根系中H2O2的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，在PD處理?xiàng)l件下，H2O2的含量比對(duì)照組的增加（P<0.05）（圖2-A），定性測(cè)定結(jié)果與定量測(cè)定結(jié)果一致（圖2-B）。

2.3MAPK對(duì)水稻根系生長素積累和分布的影響

生長素是調(diào)節(jié)根系生長的重要信號(hào)分子之一，為了解MAPK調(diào)節(jié)水稻根系的生長是否與生長素有關(guān)，本試驗(yàn)利用轉(zhuǎn)DR5-GUS 基因水稻對(duì)PD處理中根系生長素的分布和積累進(jìn)行了測(cè)定（圖3）。與對(duì)照比，PD處理5 h 和10 h使生長素在初生根根尖各區(qū)的積累都明顯增加。H2O2 處理5 h 生長素在初生根根尖各區(qū)的積累也明顯增加，但用H2O2 及其清除劑DMTU 同時(shí)處理5 h 后，生長素在成熟區(qū)和伸長區(qū)的積累減少。這3種處理?xiàng)l件下生長素在不定根根尖各區(qū)的積累與分布與初生根的類似。

2.4MAPK對(duì)水稻根系生長素基因表達(dá)譜的影響

為進(jìn)一步了解MAPK 與生長素信號(hào)的關(guān)系，利用RT-PCR 和半定量技術(shù)分析了生長素信號(hào)途徑上的關(guān)鍵基因家族包括OsPINs（生長素運(yùn)輸）、OsARFs、OsIAAs（生長素應(yīng)答）

表達(dá)的變化。圖4顯示，在PD 處理?xiàng)l件下有17個(gè)生長素基因的表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化，在這17個(gè)基因中只有3個(gè)基因（即OsPIN5a、OsPIN9、OsIAA13）的表達(dá)下調(diào)，其他14個(gè)基因（包括OsPIN1b、OsPIN5b、OsARF1、OsIAA2、OsIAA30 等）的表達(dá)水平都明顯升高，說明在正常條件下前3個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)正調(diào)控，而后14個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)負(fù)調(diào)控。PD 處理誘導(dǎo)生長素積累的變化可能與其調(diào)節(jié)生長素基因表達(dá)有密切關(guān)系。

2.5MAPK對(duì)水稻根系細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的影響

細(xì)胞分裂是控制根系生長的重要因素之一，MAPK和生長素都對(duì)細(xì)胞周期基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，試驗(yàn)進(jìn)一步分析了MAPK對(duì)細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響。由圖5可見，PD 處理使7個(gè)細(xì)胞周期基因（包括Orysa；CycB2；2、Oryza；CycU2；1、Oryza；CDKC；3、Orysa；CDKE；1、Orysa；CDKG；1、Orysa；CDKG；2、Orysa；CKL2）表達(dá)下調(diào)，12個(gè)基因（包括Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB2；1、Orysa；CycD5；1、Oryza；CDKC；1、Oryza；KRP5、Orysa；RB2 等）表達(dá)水平上調(diào)，說明正常條件下前7個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)正調(diào)控，而后12個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)負(fù)調(diào)控。PD 處理誘導(dǎo)根系生長的變化可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因表達(dá)有關(guān)。

3討論

MAPK 信號(hào)在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、激素生理過程中發(fā)揮重要作用[2]。PD 處理抑制 IAA和 ON 誘導(dǎo)的黃瓜不定根形成[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PD 處理促進(jìn)了初生根和

不定根的伸長生長，但是抑制了側(cè)根的形成與發(fā)育（圖1）。生長素影響植物根系生長發(fā)育，OsPINs、OsARFs、OsIAAs是生長素信號(hào)途徑上的關(guān)鍵基因家族[20-22]。研究表明在生長素信號(hào)傳導(dǎo)過程中存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控 MAPK 信號(hào)途徑[3-9]。 本試驗(yàn)中，PD 處理使生長素在根尖的積累增加（圖3），分子水平分析顯示該條件下多數(shù)生長素基因表達(dá)上調(diào)，說明 MAPK 信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控生長素信號(hào)，但是，有 3 個(gè)生長素基因的表達(dá)下調(diào)（圖4），暗示 MAPK 信號(hào)途徑也正調(diào)控生長素信號(hào)，這可能是因?yàn)?MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)不同成員的結(jié)合可以調(diào)控不同基因的表達(dá)。因此 MAPK 與生長素的關(guān)系復(fù)雜，既有正調(diào)控途徑也有負(fù)調(diào)控途徑。PD 對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)可能與其誘導(dǎo)生長素的增加和調(diào)控生長素基因表達(dá)有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果還說明，在正常條件下 MAPK 可能通過調(diào)節(jié)生長素基因表達(dá)控制生長素平衡。

MAPK 在細(xì)胞分裂過程中起核心作用[4，6，10-11]。細(xì)胞周期進(jìn)程受細(xì)胞周期蛋白等一系列蛋白調(diào)控[12]。MAPK 正調(diào)控細(xì)胞分裂相關(guān)基因表達(dá)[23]。但是本研究顯示，在水稻根系生長發(fā)育過程中 MAPK 對(duì)細(xì)胞周期基因表達(dá)的調(diào)節(jié)既有正調(diào)控（如Oryza；CDKC；3 和Orysa；CDKG；2 等）也有負(fù)調(diào)控（如Orysa；CycA2；1 和Oryza；KRP5等）（圖5），PD 對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)可能與其調(diào)控細(xì)胞周期基因表達(dá)有關(guān)。我們的前期研究表明，ROS 是調(diào)節(jié)水稻根系生長發(fā)育及生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)的重要信號(hào)分子[15]，MAPK 信號(hào)調(diào)節(jié) ROS 產(chǎn)生[14]，大豆 GmMPK4 基因沉默導(dǎo)致 H2O2 積累增加[23]。本研究中 PD 處理誘導(dǎo) H2O2 增加（圖2），而且 PD 誘導(dǎo)生長素積累的變化與 H2O2 處理的類似（圖3），這些結(jié)果暗示 MAPK 對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)可能還與 H2O2 有關(guān)。另外，本試驗(yàn)條件下，只有部分生長素（17個(gè)）和細(xì)胞周期（19個(gè)）基因的表達(dá)受 MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控，其余基因的表達(dá)無明顯變化，說明在調(diào)節(jié)水稻根系生長過程中還存在其他信號(hào)途徑，如 ROS 信號(hào)途徑[15]。綜上所述，MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)可能通過調(diào)節(jié) H2O2 產(chǎn)生和生長素平衡及細(xì)胞周期基因的表達(dá)參與了水稻根系生長的調(diào)控（圖6）。

參考文獻(xiàn)：

[1]Xiong L，Yang Y. Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice

are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase[J]. Plant Cell，2003，15（3）：745-759.

[2]Nakagami H，Pitzschke A，Hirt H. Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling[J]. Trends in Plant Sci，2005，10（7）：339-346.

[3]Jonak C，Okrész L，Bgre L，et al. Complexity，cross talk and integration of plant MAP kinase signalling[J]. Current Opinion in Plant Biology，2002，5（5）：415-424.

[4]Mishra N S，Tuteja R，Tuteja N. Signaling through MAP kinase networks in plants[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2006，452（1）：55-68.

[5]Mockaitis K，Howell S H. Auxin induces mitogenic activated protein kinase（MAPK）activation in Roots of Arabidopsis seedlings[J]. Plant Journal，2000，24（6）：785-796.

[6]Mizoguchi T，Gotoh Y，Nishida E，et al. Characterization of two cDNAs that encode MAP kinase homologues in Arabidopsis thaliana and analysis of the possible role of auxin in activating such kinase activities in cultured cells[J]. Plant Journal，1994，5（1）：111-122.

[7]Kovtun Y，Chiu WL，Zeng W，et al. Suppression of auxin signal transduction by a MAPK cascade in higher plants[J]. Nature，1998，395（6703）：716-720.

[8]Lee J S，Wang S，Sritubtim S，et al. Arabidopsis mitogen-activated protein kinase MPK12 interacts with the MAPK phosphatase IBR5 and regulates auxin signaling[J]. Plant Journal，2009，57（6）：975-985.

[9]Dai Y，Wang H，Li B，et al. Increased expression of MAP KINASE KINASE7 causes deficiency in polar auxin transport and leads to plant architectural abnormality in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2006，18（2）：308-320.

[10]Calderini O，Bgre L，Vicente O，et al. A cell cycle regulated MAP kinase with a possible role in cytokinesis in tobacco cells[J]. Journal of Cell Science，1998，111（Pt 20）：3091-3100.

[11]Ma Z，Yu G. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase（MAPK）is required for cytokinesis and progression of cell cycle in tobacco BY-2 cells[J]. Journal of Plant Physiology，2010，167（3）：216-221.

[12]Guo J，Song J，Wang F，et al. Genome-wide identification and expression analysis of rice cell cycle genes[J]. Plant Molecular Biology，2007，64（4）：349-360.

[13]Nakagami H，Soukupová H，Schikora A，et al. A mitogen-activated protein kinase kinase kinase mediates reactive Oxygen species homeostasis in Arabidopsis[J]. The Journal of Biological Chemistry，2006，281（50）：38697-38704.

[14]Pitzschke A，Hirt H. Disentangling the complexity of mitogen-activated protein kinases and reactive Oxygen species signaling[J]. Plant Physiology，2009，149（2）：606-615.

[15]Zhao F Y，Han M M，Zhang S Y，et al. Hydrogen peroxide-mediated growth of the root system occurs via auxin signaling modification and variations in the expression of cell-cycle genes in rice seedlings exposed to Cadmium stress[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2012，54（12）：991-1006.

[16]Chen Z H，F(xiàn)eng T T，Liu L Y，et al. Effect of glucose on zinc-induced growth of root system in rice[J]. Agricultural Science and Technology，2011，12（9）：1334-1337.

[17]Loreto F，Velikova V. Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage，quenches ozone products，and reduces lipid peroxidation of cellular membranes[J]. Plant Physiology，2001，127（4）：1781-1787.

[18]Petersson S V，Johansson A I，Kowalczyk M，et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis[J]. Plant Cell，2009，21（6）：1659-1668.

[19]Pagnussat G C，Lanteri M L，Lombardo M C，et al. Nitric oxide mediates the indole acetic acid induction activation of a mitogen-activated protein kinase cascade involved in adventitious root development[J]. Plant Physiology，2004，135（1）：279-286.

[20]Wang D，Pei K，F(xiàn)u Y，et al. Genome-wide analysis of the auxin response factors（ARF）gene family in rice （Oryza sativa L.）[J]. Gene，2007，394：13-24.

[21]Wang J R，Hu H，Wang G H，et al. Expression of PIN genes in rice（Oryza sativa L.）：tissue specificity and regulation by hormones[J]. Molecular Plant，2009，2（4）：823-831.

[22]Song Y，Wang L，Xiong L. Comprehensive expression profiling analysis of OsIAA gene family in developmental processes and in response to phytohormone and stress treatments[J]. Planta，2009，229（3）：577-591.

[23]Liu J Z，Horstman H D，Braun E，et al. Soybean homologs of MPK4 negatively regulate defense responses and positively regulate growth and development[J]. Plant Physiology，2011，157（3）：1363-1378.李旭艷，邵淑麗，張偉偉，等. 質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi沉默 mdr1基因增強(qiáng)白血病耐藥細(xì)胞HT9對(duì)姜黃素的敏感性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：22-25.