應(yīng)用宏基因組技術(shù)從微生物中獲得活性物質(zhì)的研究進(jìn)展

摘要：采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的篩選方法，地球上99%以上的微生物還沒能被人類開發(fā)生產(chǎn)活性物質(zhì)，這使得自然界中微生物資源的開發(fā)利用受到極大限制。宏基因組文庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用避開了微生物純培養(yǎng)的問題，極大拓展了微生物資源的利用空間，目前被廣泛應(yīng)用于各種新的酶及活性物質(zhì)的研究。在重點(diǎn)介紹宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及篩選方法等，以及宏基因組技術(shù)在微生物活性物質(zhì)篩選中應(yīng)用的基礎(chǔ)上，對(duì)宏基因組研究存在的問題進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞：宏基因組文庫(kù)；微生物；活性物質(zhì)；篩選

中圖分類號(hào)： Q789文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0005-03

收稿日期：2013-05-24

作者簡(jiǎn)介：高岳（1979—），男，江蘇蘇州人，博士，講師，從事生物工程及微生物天然產(chǎn)物研究。Tel：（0512）66098727；E-mail：gaoyue0605@163.com。環(huán)境當(dāng)中有超過99%的微生物不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，大多數(shù)微生物還沒能被人類用來(lái)開發(fā)生產(chǎn)可能的有用產(chǎn)物[1-2]。用傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法沒有辦法對(duì)不可培養(yǎng)微生物的酶及其產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，但是，通過“宏基因組學(xué)”研究方法，可以直接從環(huán)境樣品中提取微生物DNA，讓微生物DNA在易培養(yǎng)宿主中克隆表達(dá)[3]。從自然界微生物群落中直接提取DNA后建立宏基因組文庫(kù)，然后進(jìn)行克隆篩選，目前被廣泛應(yīng)用于各種新的酶及活性物質(zhì)的研究。

1宏基因組學(xué)的概念

1998年，Handelsman等首次提出了宏基因組（metagenome）的概念，是指特定環(huán)境中全部微生物基因的總和。宏基因組學(xué)（metagenomics）是一種新的微生物研究方法，它以環(huán)境樣品中微生物群體基因組為研究對(duì)象，通過基因篩選和序列分析等手段，來(lái)研究環(huán)境微生物的功能活性、多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系，以及它們與環(huán)境之間的關(guān)系。宏基因組文庫(kù)包含了可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物基因的總和，不需要使用傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)，極大地拓寬了微生物資源的利用空間，為獲得新的酶及生物活性物質(zhì)提供了更廣闊的平臺(tái)。

2宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建

2.1DNA提取

DNA提取方法主要有2種：一種是直接（原位）裂解法，直接裂解環(huán)境樣品中的微生物細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提。這種方法操作簡(jiǎn)單、成本較低、DNA獲得率比較高，也更具有代表性；但提出的DNA片段較小（1～50 kb），且用這種方法容易殘留環(huán)境樣品中的雜質(zhì)，如腐殖酸、棕黃酸等，這些雜質(zhì)對(duì)后續(xù)的PCR擴(kuò)增等操作會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。另一種是間接（異位）裂解法，即先采用差速離心等物理手段，將微生物細(xì)胞從環(huán)境樣品中分離出來(lái)，再用較溫和的方法來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行抽提。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得大片段DNA（20～500 kb），而且純度高、雜質(zhì)殘留少；但這種方法操作繁瑣，成本較高，DNA 獲得率比較低，且用此法抽提到的DNA主要來(lái)自于和土壤顆粒附著力較弱的微生物個(gè)體。因此，要根據(jù)研究手段及目的基因的大小，選擇合適的提取方法。Liles等證明了用甲酰胺高鹽溶液處理的樣品能夠提取大片段DNA，并能有效地提高宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建效率，這為獲取完整的大片段DNA提供了可借鑒的方法[4]。

2.2文庫(kù)構(gòu)建

從環(huán)境樣品中提取DNA，用于構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，進(jìn)而篩選各種活性物質(zhì)。在構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，應(yīng)根據(jù)自身的研究目的和獲得的DNA的量、純度、片段大小等來(lái)選擇載體和宿主。

載體的選擇需要考慮載體的大小、載體拷貝數(shù)、插入片段的大小、所用宿主及篩選方法等因素[5]。常用的克隆載體包括質(zhì)粒（plasmid，插入片段10 kb以下）、黏粒（cosmid，插入片段40 kb左右）和細(xì)菌人工染色體（BAC，插入片段可達(dá) 350 kb）等，可滿足不同的插入片段大小要求。BAC 載體可以克隆大片段的DNA，增加了獲得完整的指導(dǎo)大分子活性物質(zhì)合成途徑的編碼基因或基因簇的機(jī)會(huì)，在宏基因組克隆表達(dá)中具有一定的優(yōu)勢(shì)。Gillespie等用細(xì)菌人工染色體載體pBeloBACⅡ構(gòu)建了2個(gè)土壤樣品的宏基因組BAC文庫(kù)，獲得了2 個(gè)具有廣譜抗菌作用的新抗生素turbomycin A和 turbomycin B 及其合成酶基因簇[6]。

宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、外源基因的表達(dá)、目標(biāo)性狀篩選等因素[5]。研究結(jié)果表明，不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型有明顯差異，因此，可根據(jù)不同研究目標(biāo)選擇不同的宿主菌株，如70%的抗生素來(lái)源于放線菌，若尋找抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)，應(yīng)選擇鏈霉菌為宿主菌，而大腸桿菌則主要用于新型酶的篩選等[7]。大腸桿菌作為成熟的基因克隆表達(dá)受體細(xì)胞，仍然是研究宏基因組的首選宿主菌，如紫色桿菌素（violacein）C等在大腸桿菌中的成功表達(dá)[8]。鏈霉菌屬編碼次生代謝產(chǎn)物合成的基因以基因簇的形式存在，表達(dá)受到細(xì)胞信號(hào)交流和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，具備天然抗生素產(chǎn)生機(jī)制[9]。

3活性物質(zhì)文庫(kù)的篩選

采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行生物活性物質(zhì)篩選時(shí)，一般都是獲得相應(yīng)的混合物，然后還需要進(jìn)行活性化合物分離、提純和鑒定等一系列后續(xù)處理。高品質(zhì)的活性物質(zhì)分析需要培養(yǎng)或發(fā)酵，產(chǎn)生某種活性物質(zhì)的細(xì)菌，在發(fā)酵時(shí)其合成能力可能會(huì)降低，甚至喪失。應(yīng)用宏基因組技術(shù)進(jìn)行篩選時(shí)，由于合成該物質(zhì)的基因攜帶在一定載體上，其功能基本不會(huì)丟失。活性物質(zhì)文庫(kù)篩選是細(xì)菌之間通用某些功能基因及其表達(dá)調(diào)控子，克服了發(fā)酵限制，優(yōu)越于傳統(tǒng)篩選。基于環(huán)境宏基因組的高度復(fù)雜性，必須有高通量、高靈敏度的方法來(lái)篩選和鑒定文庫(kù)中的目標(biāo)基因或活性分子。應(yīng)用宏基因組技術(shù)篩選活性物質(zhì)時(shí)，根據(jù)目的不同，可從以下不同水平設(shè)計(jì)不同的篩選方案。

3.1序列驅(qū)動(dòng)篩選

序列驅(qū)動(dòng)篩選是指根據(jù)已知的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的保守序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，通過核酸雜交或PCR擴(kuò)增，篩選具有目標(biāo)序列的克隆子，以獲得某一類結(jié)構(gòu)或功能類似的蛋白質(zhì)新分子或其編碼基因[10-11]。來(lái)自海綿具有藥用價(jià)值的天然產(chǎn)物大多數(shù)是復(fù)雜的聚酮類化合物，海綿宏基因組編碼許多指導(dǎo)不同途徑的聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）[12-13]。PKS包括1個(gè)或多個(gè)模塊，每個(gè)模塊都至少包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：酮體合成酶（ketosynthase，KS）、酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl transferase，AT）、酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP），其中，KS編碼區(qū)同源性最高，因此，可以根據(jù)KS結(jié)構(gòu)域的保守序列設(shè)計(jì)PCR引物[12-14]，從海綿宏基因組文庫(kù)中篩選攜帶PKS基因的克隆。Courtoi等構(gòu)建了1個(gè)可以在大腸桿菌和鏈霉菌間轉(zhuǎn)移的穿梭Cosmid載體，并以此構(gòu)建了1個(gè)土壤宏基因組文庫(kù)，通過序列驅(qū)動(dòng)篩選獲得了新的抗腫瘤活性物質(zhì)聚酮的合成酶基因簇[15]。序列篩選法的優(yōu)點(diǎn)是不必依賴外源基因在宿主中的表達(dá)，但它無(wú)法篩選宏基因組文庫(kù)中那些和現(xiàn)有基因序列完全不同的新基因，因此較難發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)。不過，Gupta等認(rèn)為，當(dāng)宏基因組文庫(kù)基因的保守序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因的保守序列相似度低于40%時(shí)，基于序列的篩選策略也可能篩選到新的功能產(chǎn)物[16]。

3.2功能驅(qū)動(dòng)篩選

功能驅(qū)動(dòng)篩選主要通過化學(xué)等手段，從宏基因組文庫(kù)中檢測(cè)表達(dá)目標(biāo)活性物質(zhì)的克隆子，這種方法具有較高靈敏度，產(chǎn)色素的陽(yáng)性克隆在平板上呈現(xiàn)的顏色不同，可以被快速篩選出來(lái)，如Huang等從構(gòu)建的中國(guó)南海深海沉積物Fosmid宏基因組文庫(kù)中篩選到了產(chǎn)黑色素（melanin）的克隆[17]；或是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條件下功能互補(bǔ)生長(zhǎng)的特性進(jìn)行篩選[18]。Hu等在1個(gè)南極荒漠土壤宏基因組文庫(kù)中，使用含有底物甘油三酸酯三丁酸甘油酯的瓊脂平板篩選到1種新的酯酶[19]。Neveu等從戈壁和死亡谷沙漠宏基因組文庫(kù)中，在用脫脂牛奶作為底物的平板上分離到2個(gè)絲氨酸蛋白酶[20]。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能找到各種新的酶及活性物質(zhì)，但它受限于基因必須能在宿主中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能夠正常溶解，并且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要能夠正確地折疊。然而，很多克隆的外源基因并不能在新的遺傳背景中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

3.3功能篩選法的改進(jìn)

宏基因組文庫(kù)在進(jìn)行功能篩選時(shí)，存在諸多問題，需要對(duì)宿主及載體系統(tǒng)進(jìn)行改造及完善，改進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)，從而解決宏基因組基因在多宿主系統(tǒng)中的表達(dá)問題，如：可采用穿梭載體，使其在不同宿主中進(jìn)行目的基因的表達(dá)，或是對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造，擴(kuò)大它對(duì)基因的表達(dá)范圍。目前，宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建常采用的表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌和鏈霉菌，可以通過綜合考慮宿主的天然生物合成能力和它對(duì)外源啟動(dòng)子的傾向性，拓展新的宿主菌用于宏基因組的研究。Craig等以R. metallidurans為克隆宿主，成功獲得了土壤eDNA 的編碼產(chǎn)物，其中有2個(gè)是新天然產(chǎn)物，他們還進(jìn)一步驗(yàn)證了獲得的產(chǎn)物在大腸桿菌中不能表達(dá)或無(wú)法被檢測(cè)到表達(dá)，進(jìn)而證明了Ralstonia metallidurans可以作為宏基因組學(xué)文庫(kù)新的模式系統(tǒng)，用于發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)物[21]。另外，還可結(jié)合其他相關(guān)技術(shù)來(lái)改進(jìn)功能篩選法，如在克隆前運(yùn)用超速離心法、密度梯度離心法、穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)等[22-23]，對(duì)樣品中感興趣的基因或基因組進(jìn)行富集，從而提高陽(yáng)性克隆的比例。將親和篩選技術(shù)和噬菌體表面展示表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合起來(lái)分離DNA，是一個(gè)高效易控制的高通量篩選方法，在宏基因組文庫(kù)中即使是稀少的DNA序列也可得到富集，有利于文庫(kù)中稀有DNA序列的表達(dá)[24]。

4部分微生物活性物質(zhì)篩選情況

利用宏基因組技術(shù)篩選活性物質(zhì)被證實(shí)是一種行之有效的方法，其效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他方法并且具有廣闊的前景，是基因工程研究的一個(gè)主要方向。目前，研究人員已經(jīng)利用功能和序列為基礎(chǔ)的方法通過宏基因組篩選，鑒定了比較多的新型酶及抗菌活性物質(zhì)（表1），潛在的工業(yè)開發(fā)利用價(jià)值很大。

表1宏基因組文庫(kù)篩選的活性物質(zhì)

活性物質(zhì)1文獻(xiàn)β-半乳糖苷酶1Wang等[25] ，2010鞣酸酶1Yao等[26]，2011α-淀粉酶1Liu等[27]，2012內(nèi)切葡聚糖酶1Pang等[28]，2009內(nèi)酯酶1Schipper等[29] ，2009DNA聚合酶1Simon等[30]，2009ATP酶1de la Iglesia等[31]，2010糖肽基因1Banik 等[32]，2008核糖體環(huán)肽1Sivonen等[33]，2010抗癌物patellamide基因1Long等[34]，2005Ⅱ型聚酮合成酶基因1King等[35]，2009抗癌物ET-743基因1Rath等[36]，2011阿普拉毒素 1Grindberg等[37]，2011異氰化物1Brady等[38]，2005靛紅、靛藍(lán)1Lim等[39]，2005低溫脂肪酶1Jeon等[40]，2009耐鹽纖維素酶1Voget等[41]，2006多酚氧化酶1Beloqui等[42]，2006羧酸酯酶1Rashamuse等[43]，2009雙加氧酶1Suenaga等[44]，2007

5展望

運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)，有可能挖掘和利用99%以上的不可培養(yǎng)微生物，這些微生物蘊(yùn)藏著巨大的基因多樣性，提供了豐富的研究資源。雖然采用宏基因組技術(shù)獲得的活性物質(zhì)目前并不是很多，但它改變了我們解決很多問題的思路，豐富和拓展了對(duì)微生物世界多樣性的認(rèn)識(shí)，加速了新基因的發(fā)現(xiàn)。隨著未來(lái)研究手段的不斷進(jìn)步，細(xì)菌遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)、合成生物學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)等學(xué)科和領(lǐng)域的發(fā)展，必將使我們能從各類環(huán)境基因組文庫(kù)中獲得更多具有高價(jià)值的新酶、抗生素和其他活性產(chǎn)物，宏基因組學(xué)技術(shù)也必將發(fā)揮越來(lái)越大的作用，造福人類。

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