替硝唑栓微生物限度檢查方法學研究

蔣彥潔 凌明 張笑顏

·實驗研究·

替硝唑栓微生物限度檢查方法學研究

蔣彥潔 凌明 張笑顏

目的對替硝唑栓的微生物限度檢查方法進行研究。方法按照《中華人民共和國藥典》2010年版附錄的要求進行方法學驗證, 細菌計數(shù)采用低速離心-薄膜過濾法, 真菌及酵母菌計數(shù)采用薄膜過濾法, 控制菌檢查采用薄膜過濾法與低速離心-薄膜過濾法。結果細菌、真菌及酵母菌的回收率均＞70.0%, 控制菌檢查中, 各陽性試驗菌均檢出, 陰性對照無菌生長。結論薄膜過濾法與低速離心-薄膜過濾法可消除替硝唑栓的抑菌作用, 適用于該制劑的微生物限度檢查。

替硝唑栓；微生物限度檢查

替硝唑栓屬于婦科常用藥, 有抗滴蟲和抗厭氧菌效果,常用于滴蟲性和細菌性陰道炎治療。由于替硝唑栓有較強的抑菌效果, 并且《中華人民共和國藥典》［1］(2010年版)對藥品微生物限度檢驗方法做了相應的要求, 作者結合栓劑的微生物檢查法［2］對其微生物檢驗方法進行驗證以考察其檢驗標準是否科學合理。

1 材料與方法

1.1材料 無菌十四烷酸異丙酯、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基。

1.2菌種 銅綠假單胞菌［ CMCC(B)10104］(菌種1)、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］(菌種2)、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］(菌種3)、大腸埃希菌［CMCC(B) 44102］(菌種4)、白色念珠菌［CMCC(F)98001］(菌種5)、黑曲霉菌［CMCC(F)98003］(菌種6)。

1.3樣品 替硝唑栓(廣州白云山制藥股份有限公司, 批號：X1002, 規(guī)格：1g)。

1.4實驗儀器 MLS-3750高壓滅菌鍋(三洋工業(yè)株式會社)；XW-80A渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；SWCJ-2F0超級潔凈工作臺(蘇州市安泰空氣技術有限公司)；DHP-9279恒溫細菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；Microfil全自動微生物限度過濾系統(tǒng)(美國默克-密理博公司)；SE601F電子天平(奧豪斯儀器公司)。

1.5方法

1.5.1制備菌液 在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接種菌種1-4的新鮮斜面培養(yǎng)物并在30～35℃培養(yǎng)24 h；在改良馬丁培養(yǎng)基中接種菌種5的新鮮斜面培養(yǎng)物并在23～28℃培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)結束后, 用0.9%無菌氯化鈉溶液將這些培養(yǎng)液稀釋至10-5、10-6、10-7, 制成50～100 cfu/ml的菌液備用。用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的無菌氯化鈉溶液［2］加入菌種6的新鮮斜面培養(yǎng)物以清洗孢子, 并用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4, 制成50～100 cfu/ml的孢子懸液以備用。

1.5.2制備供試液 取10 g供試品于含無菌玻璃珠的錐形瓶中, 并加入無菌十四烷酸異丙酯5 ml, 搖動使其充分溶解,然后加入100 ml 45℃氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH7.0)并搖動5～10 min, 萃取, 靜置, 取水層為供試液(1∶10)。

1.5.3驗證酵母菌、真菌和細菌計數(shù)方法

1.5.3.1常規(guī)法驗證菌落計數(shù)方法 ①試驗組：取1 ml供試液分別注入10個平皿中, 分別加入1 ml含50～100 cfu/ml的菌種2-6的菌懸液(每種菌平行制備2個平皿), 分別加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基, 然后分別培養(yǎng)3 d (30～35℃)和5 d(23～28℃)。②菌液組：分別取1 ml制備好的菌液加入兩個平皿內(nèi)(平行制備), 測定所加實驗菌數(shù)。③供試品對照組：取1 ml供試液(1:10)分別注入5個平皿并立即加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基, 分別培養(yǎng)3 d(30～35℃)和5 d(23～28℃)。測定供試品本底菌數(shù)。

1.5.3.2培養(yǎng)基稀釋法 ①試驗組：取1 ml供試液(1:10)分別注入5個平皿中(均分), 分別加入1ml含50～100 cfu/ml的菌種2-6的菌懸液(每種平行制備2個平皿), 分別加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(立即), 然后分別培養(yǎng)3 d(30～35℃)和5 d(23～28℃)。②菌液組：取1ml上述制備好的各種菌液分別注入兩個平皿內(nèi)(平行制備), 測定所加實驗菌數(shù)。③供試品對照組：取1 ml供試液分別注入5個平皿中(均分), 平行制備兩組并立即加入20 ml左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 培養(yǎng)后計數(shù)。④稀釋劑對照組：取1 ml氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH7.0)替代供試液, 方法同試驗組。

1.5.3.3薄膜過濾法與低速離心-薄膜過濾法 ①試驗組：取10 ml供試液(1:10), 于無菌條件下離心3 min(500 r/min), 取 1 ml上清液并加稀釋劑, 薄膜法過濾(800 ml沖洗量), 最后一次沖洗液中加入1 ml相應陽性細菌試驗菌, 取出濾膜并貼于營養(yǎng)瓊脂平板上(菌面朝上), 培養(yǎng)后測定細菌數(shù)；因《中國藥典》(二部)規(guī)定離心沉淀法不能用于霉菌及酵母菌計數(shù)檢查, 故采用薄膜過濾法, 取1 ml供試液(1:10), 加稀釋劑并用薄膜法過濾(800 ml沖洗量), 最后一次沖洗液中加入1 ml相應真菌及酵母菌試驗菌, 取出濾膜并貼于玫瑰紅鈉瓊脂平板上(菌面朝上), 培養(yǎng)后測定真菌及酵母菌數(shù)。②菌液組：取1 ml上述稀釋的陽性菌菌液至平皿中并立刻加入相應的培養(yǎng)基, 規(guī)定條件培養(yǎng)后測定各陽性菌的菌落數(shù)。③供試品對照組：方法同試驗組, 但不加陽性對照菌以測定樣品本底的菌數(shù)。④稀釋劑對照組：方法同試驗組, 但用稀釋劑代替供試液測定。

1.5.3.4回收率公式 試驗組菌回收率(%)=( 試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。稀釋劑對照組菌回收率(%)=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%。

2 結果

2.1常規(guī)法菌落計數(shù)的結果見表1。

2.2培養(yǎng)基稀釋法菌落計數(shù)的結果見表2。

2.3薄膜過濾法與低速離心-薄膜過濾法菌落計數(shù)的結果見表3。

表1常規(guī)法測定細菌、霉菌和酵母菌回收率(cfu, %)

表2培養(yǎng)基稀釋法測定細菌、霉菌和酵母菌回收率的測定(cfu, %)

表3薄膜過濾法與低速離心-薄膜過濾法測定細菌、霉菌和酵母菌回收率(cfu, %)

結果判斷：對替硝唑栓進行3次獨立平行微生物限度檢查方法回收率試驗, 5株試驗菌的試驗組菌回收率＞70%, 且稀釋劑對照組的菌回收率也＞70%, 說明運用本方法可以消除供試品的抑菌性, 且受試微生物的活性并未受供試液制備過程的影響, 故可采用該法進行樣品中的細菌、真菌及酵母菌數(shù)的測定。

2.4驗證控制菌檢查方法

2.4.1試驗組 取2份10 ml的供試液(1:10), 方法同“1.5.3.3”,使用600 ml沖洗液沖洗, 并于最后一次沖洗液中加入陽性對照菌菌種1和菌種3菌液各1 ml, 取出濾膜, 分別接種于膽鹽乳糖培養(yǎng)基(100 ml)和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(100 ml)中, 搖勻, 培養(yǎng)18～24 h(30～35℃)；另10 ml的供試液(1:10), 加稀釋劑適量,依薄膜過濾法過濾(沖洗液為800 ml), 并加入陽性對照菌菌種5菌液1 ml于最后一次沖洗液中, 取出濾膜, 接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(100 ml)中, 培養(yǎng)24～48 h(23～28℃)。

2.4.2陰性對照組 取等量稀釋劑, 方法與試驗組相同(不加陽性對照菌菌液)。

2.4.3驗證結果 試驗組檢出陽性試驗菌, 且陰性對照組無菌生長, 結果見表4。試驗組檢出陽性實驗菌, 而陰性對照組無菌檢出, 故可使用該供試液制備法與控制菌檢查法進行控制菌的檢查。

表4控制菌檢查方法學的驗證結果

3 討論

因為替硝唑栓具有較強的抑菌作用, 所以, 微生物限度檢查可采用低速離心-薄膜過濾法與薄膜過濾法聯(lián)合的方法進行測定, 以確保樣品的抑菌作用能夠被有效去除。并且依照《中華人民共和國藥典》2010年版附錄中對微生物限度檢查方法的要求, 將離心時間由5 min縮短至3 min。

替硝唑栓為陰道用藥, 《中華人民共和國藥典》2010年版附錄中微生物限度檢查法明確規(guī)定, 陰道、尿道給藥制劑應增加對白念珠菌的檢查, 且控制菌檢查中取消對陰性對照菌的檢查, 增加測定稀釋劑作為陰性對照, 結果應無菌生長。

對替硝唑栓微生物限度檢查方法3次獨立的的回收率試驗結果表明：替硝唑栓采用薄膜過濾法與低速離心-薄膜過濾法測定其微生物限度, 回收率均＞70%, 符合微生物限度檢查方法適用性測定中可靠性［3,4］的要求。此后對替硝唑栓微生物限度的檢測可采用該方法。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典( 二部).北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2010:107-116.

［2］ 陸蓓.幾種栓劑的微生物限度檢查法的驗證.西北藥學雜志, 2006, 21(3):121-122.

［3］ 李云龍.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范.北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2010:400.

［4］ 苑思坤, 李玉芝, 王紅云.微生物限度檢查薄膜過濾法供試液預處理方法探討.藥物鑒定, 2010, 19(18):42-43.

Methodological study on microbial limit test of tinidazole suppositories

JIANG Yan-jie, LING Ming, ZHANG Xiao-yan.
Zhejiang Jinhua Institute for Food and Drug Control, Jinhua 321000, China

ObjectiveTo study the method of microbial limit test of tinidazole suppositories.MethodsAccording to the appendix of Chinese Pharmacopoeia (2010 edition), methodology validation was taken in the test.Low-speed centrifugal-membrane filtration method was applied for bacteria counting, and membrane filtration method was used for fungus and saccharomycetes counting.Both the above methods were used in control bacteria check.ResultsThe recovery rates of bacteria, fungus, and saccharomycetes were all ＞70.0%.The results of control bacteria check showed that all positive test bacteria were detected, and no negative control bacteria occurred.ConclusionBoth of membrane filtration method and low-speed centrifugal-membrane filtration method can eliminate the bacteriostasis of tinidazole suppositories, and they are applicable to the microbial limit test of tinidazole suppositories.

Tinidazole suppositories; Microbial limit test

2014-08-22］

321000 浙江省金華市食品藥品檢驗所