HPLC法進(jìn)行芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測定

王璐

HPLC法進(jìn)行芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測定

王璐

目的探討高壓液相色譜法(HPLC法)在芩霍雙清飲中黃芩苷含量測定中的應(yīng)用情況。方法采用HPLC法, 選取Merk C作為色譜柱, 以體積比為2:3的甲醇(CH3OH)與濃度為0.3%的磷酸溶液作為流動相, 混合溶液流速為1 ml/min, 檢測波長λ=280 nm。對此種方法下的黃芩苷含量進(jìn)行測定分析。結(jié)果黃芩苷平均回收率為97.65%, 平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.67%。結(jié)論HPLC法測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量, 方法簡便、確切以及重現(xiàn)性較好, 可應(yīng)用于芩霍雙清飲中黃芩苷的定量測定與分析之中, 應(yīng)加以推廣及應(yīng)用。

高效液相色譜法；芩霍雙清飲；黃芩苷

芩霍雙清飲為臨床上較為常見的一種中藥制劑, 其主要成分為黃芩苷。具有清熱燥濕、瀉火解表之功效, 對尋常型痤瘡、膿皰型痤瘡有良好的治療效果［1］。本研究主要采用高效液相色譜法對其中的黃芩苷含量進(jìn)行測定分析, 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與方法

1.1儀器 HPLC色譜儀：Waters色譜儀；色譜檢測器：Waters-2847紫外檢測器；色譜工作站：Waters-2695色譜工作站；色譜柱：Merck-C18, 規(guī)格為150 mm×4.6 mm；純水機(jī)；電子天平等儀器。

1.2藥品 對照藥品：黃芩苷(批號：20130318, 本院自行研制)；試劑：CH3OH、磷酸、C2H5OH(AR)以及超純水等。

1.3方法

1.3.1色譜條件的選擇 色譜柱：Merck-C18, 規(guī)格為150 mm×4.6 mm；流動相：CH3OH+0.3%磷酸溶液(溶液體積比為2:3)作為流動相；色譜柱溫度設(shè)置為30℃；流速設(shè)置為1 ml/min；波長：280 nm；進(jìn)樣量設(shè)置為每次進(jìn)樣10 μl［2］。

1.3.2供試品溶液的制備 準(zhǔn)確地取2 ml供試品溶液, 將其加入至50 ml的容量瓶之中, 再向其加入濃度為70%的C2H5OH溶液之中, 并調(diào)節(jié)至刻度, 搖勻, 定容；再準(zhǔn)確地取2.5 ml的續(xù)濾液, 并將其加入50 ml的容量瓶之中, 并加入濃度為70%的C2H5OH稀釋至刻度線處, 定容, 然后用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜, 吸取濾液, 則可得到供試品溶液［3］。

1.3.3對照品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取黃芩苷對照品置于一定容積的量瓶之中, 使用CH3OH來配置單組份對照品貯備液, 其濃度分別為2.67、1.04、1.31 mg/ml。然后分別準(zhǔn)確地量取一定量的各單組分對照品貯備液, 并將其配制成混合對照品溶液, 其中黃芩苷為0.40 mg/ml。

1.3.4陰性對照干擾試驗(yàn) 根據(jù)處方比例以及制備工藝,并配制成為不含有黃芩苷的陰性對照樣品, 根據(jù)“1.3.2”方法制備成為陰性對照溶液。在“1.3.1”方法的色譜條件下,分別吸取對照品溶液、陰性對照溶液各為10 μl, 注入液相色譜儀, 根據(jù)含量測定的方法對其進(jìn)行測定分析。

1.3.5線性相關(guān)性分析 取“1.3.3”下的對照品溶液, 分別進(jìn)樣2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μl, 并對色譜的峰面積進(jìn)行測定分析, 以對照品進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo), 峰面積作為縱坐標(biāo), 并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線, 從而得到回歸方程, 利用Excel軟件計(jì)算相關(guān)性系數(shù)。

1.3.6精密度試驗(yàn)分析 準(zhǔn)確地測定10 μl對照品溶液, 并將其注入至色譜儀之中, 連續(xù)重復(fù)測定6次, 并測定器峰面積以及計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD［4］。

1.3.7加樣回收試驗(yàn) 準(zhǔn)確地稱取已知含量的本研究中選擇的中藥合劑6份, 每份的量均為1 ml, 分別準(zhǔn)確地加入黃芩苷對照品, 根據(jù)“1.3.2”中的方法來制備供試品溶液。計(jì)算回收率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Excel軟件計(jì)算相關(guān)性系數(shù)。進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1線性關(guān)系 取混合對照品溶液分別將其稀釋至3、5、10、15、20、25倍, 根據(jù)上述色譜條件, 均進(jìn)樣20 μl, 對其峰面積進(jìn)行測定、分析, 將峰面積積分值作為橫坐標(biāo)(X), 進(jìn)樣量(μg)作為縱坐標(biāo)(Y), 對其進(jìn)行線性回歸分析, 具體結(jié)果見表1。

2.2HPLC法下的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果 黃芩苷平均回收率為97.65%, 平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.67%, 見表2。

表1 各個(gè)組分線性關(guān)系分析結(jié)果

表2 HPLC法下的黃芩苷加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n, %)

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 用HPLC法測定含芩霍雙清飲中黃芩苷的含量, 方法簡便, 結(jié)果準(zhǔn)確, 可有效控制藥品質(zhì)量, 確保療效［5］。因此, 作者測定芩霍雙清飲中中黃芩苷的含量方法完全按照《中國藥典》 規(guī)定的色譜條件進(jìn)行, 即檢測波長為280 nm。在此色譜條件下, 黃芩苷主峰無干擾, 理論塔板數(shù)均在2000以上, 主峰前、后分離度均＞2, 完全達(dá)到藥典含量檢測的規(guī)定和要求［6］。在實(shí)際的操作過程中, 還應(yīng)注意一些問題, 如采用純甲醇和流動相兩種溶劑分別對樣品進(jìn)行超聲提取, 結(jié)果顯示, 僅僅用甲醇超聲提取, 樣品提取不是很完全, 選用流動相先加熱回流3 h, 提取率高, 再測定黃芩苷的含量, 為了避免其他成分的干擾, 每針樣品進(jìn)樣分析時(shí)間不得＜35 min。

黃芩為芩霍雙清飲合劑中的主藥之一, 黃芩苷為其主要活性成分之一, 具有抗菌抗炎、清熱解毒的作用［3］, 采用HPLC法對黃芩中的主要成分黃芩苷進(jìn)行含量測定。取黃芩苷對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描, 圖譜中黃芩苷在280 nm波長處有較大吸收, 故以280 nm為檢測波長［4］。曾試用Kromasil Cl8、Merck Cl8、CAPCELL PAK C18等多種品牌的色譜柱, 各色譜柱所得待測成分色譜峰峰形好, 分離理想, 本實(shí)驗(yàn)色譜柱采用Merck C18色譜柱。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶解樣品的溶劑對黃芩苷的峰形有很大影響, 若只以甲醇作為溶劑, 黃芩苷的色譜峰會出現(xiàn)明顯肩峰,而改用流動相作為溶劑后, 肩峰完全消失, 峰形明顯改善。此外, 在樣品的制備過程中發(fā)現(xiàn)加入甲醇后, 樣品會出現(xiàn)較多的絮狀沉淀, 易阻止黃芩苷的進(jìn)一步析出和溶解, 若直接過濾, 將導(dǎo)致黃芩苷的溶解不完全, 使樣品回收率偏低。本文采用超速離心并進(jìn)一步用甲醇洗滌沉淀進(jìn)行處理, 可使回收率大大提高, 結(jié)果理想, 重現(xiàn)性好。

綜上所述, HPLC法測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量,方法簡便、確切以及重現(xiàn)性較好, 可應(yīng)用于芩霍雙清飲中黃芩苷的定量測定與分析之中, 應(yīng)加以推廣及應(yīng)用。

［1］ 黃雄, 黃嬛, 黃佳, 等.HPLC 同時(shí)測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志, 2009, 26(5):417-419.

［2］ 張婷, 美爾哈巴·熱西提, 林瀟, 等.HPLC-MS /MS法測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷.中草藥, 2012, 43(4):711-713.

［3］ 張靜, 劉文翔, 韓艷婷, 等.HPLC 測定銀黃口服液中綠原酸、黃芩苷和木犀草苷的含量.西北藥學(xué)雜志, 2011, 26(4):237-239.

［4］ 魏大華, 馮敬文, 王四元, 等.小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測定方法研究.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 26(4):373-376.

［5］ 胡世強(qiáng), 張偉, 張永耀.RP-HPLC 法同時(shí)測定不同廠家銀黃顆粒中綠原酸、木犀草苷和黃芩苷的含量.今日藥學(xué), 2013, 23(8): 490-493.

［6］ 付艷敏, 李伯軍.HPLC法測定雙黃消炎片中黃芩苷的含量.中國藥師, 2008, 11(6):654-655.

2014-06-24］

473000 南陽市中醫(yī)院藥劑科