搖蚊基因組DNA的提取方法研究

方響亮，彭 琴，伊劍鋒，萬(wàn) 瑋，傅 悅*

(1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000;2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院)，湖北恩施 445000)

作為現(xiàn)代生物系統(tǒng)學(xué)和生物進(jìn)化學(xué)研究的熱點(diǎn)方向之一，分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)在鑒別動(dòng)物物種、遺傳多樣性分析以及物種起源和進(jìn)化等方面的研究中常被用到.目前，該技術(shù)已普遍應(yīng)用到昆蟲(chóng)的相關(guān)研究上.基因組DNA的提取質(zhì)量是開(kāi)展后續(xù)分析檢測(cè)工作的重要基礎(chǔ)，為了成功從昆蟲(chóng)中提取到高質(zhì)量的基因組DNA，前人就其提取方法進(jìn)行過(guò)大量的研究.張大治等［1］運(yùn)用CTAB法和蛋白酶K法(SDS法)提取蜻蜓基因組DNA，研究結(jié)果表明2種方法均較適宜.楊子祥［2］證明了利用平衡酚法提取蚜蟲(chóng)基因組DNA的可行性.張民照等［3］和葛風(fēng)偉等［4］分別對(duì)直翅目昆蟲(chóng)的基因組DNA提取方法進(jìn)行過(guò)研究，前者認(rèn)為平衡酚法效果甚佳，后者則認(rèn)為SDS法較好.代金霞等［5］、劉漩等［6］分別對(duì)擬步甲科昆蟲(chóng)的基因組DNA的提取方法進(jìn)行探討，前者的結(jié)果顯示SDS法較可行，后者則得出CTAB法較有效.田英芳等［7］曾利用SDS法提取蟋蟀、螽斯、蝗蟲(chóng)、天牛和蜻蜓的基因組DNA，提取效果都較理想.印紅等［8］采用改良的平衡酚法提取過(guò)果蠅、蝗蟲(chóng)、七星瓢蟲(chóng)和鈍齒瑟蟲(chóng)的基因組DNA，其效果良好.通過(guò)前人的研究發(fā)現(xiàn)，用于昆蟲(chóng)基因組提取的方法主要包括基因組DNA提取試劑盒法SK8222、蛋白酶K法、SDS－苯酚法、平衡酚法、SDS法、CTAB法、NaCl法等.

搖蚊(Chirinomids)屬于昆蟲(chóng)綱(Insecta)、雙翅目(Diperta)、長(zhǎng)角亞目(Nematocera)、蚊總科(Culicomorpha)、搖蚊科(Ceratopogonidae)，是一種世界性分布的水生昆蟲(chóng)，幾乎遍及所有的淡水生境.常利用搖蚊幼蟲(chóng)進(jìn)行水質(zhì)監(jiān)測(cè)、生態(tài)毒理學(xué)以及遺傳毒理學(xué)等方面的研究.搖蚊成蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)方向的研究更受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，長(zhǎng)期以來(lái)運(yùn)用形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi)，并取得了顯著成果，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近幾年搖蚊分子水平的研究逐漸受到重視.本研究分別使用上海生工生物有限公司提供的動(dòng)物基因組DNA快速提取試劑盒法以及SDS法、CTAB法、NaCl法提取搖蚊的基因組DNA，進(jìn)行效果比較，以期篩選出最適宜搖蚊科昆蟲(chóng)基因組DNA的提取方法，為搖蚊科昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究做好基礎(chǔ)工作.

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所選搖蚊為成蟲(chóng)，于2014年4月采自湖北省恩施市湖北民族學(xué)院校園內(nèi)，用85%乙醇浸泡保存.

1.2 試驗(yàn)儀器、用品及試劑

1.2.1 試驗(yàn)儀器 立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng))，電動(dòng)組織研磨器(EQ6002，生工生物工程(上海)有限公司)，臺(tái)式離心機(jī)(Centrifuge 5415R，Eppendof AG22331 Hamburg)，漩渦混合器(XW－80A，上海青浦滬西儀器廠(chǎng))，恒溫水浴鍋(HHS型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng))，移液搶(Genex pipette)，微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific NANODROP 2000C)，掌上離心機(jī)(Scilogex D1008E，美國(guó)賽洛捷克)，PCR儀(Applied Biosystems 2720 Thermal Cycle)，電子天平(Sartorius BS2245，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，微波爐(格蘭仕G70D20CSP－D2CS0)，電泳儀(DYY－10C型)和電泳槽(DYCP－31DN 型，北京市六一儀器廠(chǎng))，凝膠成像儀(Universal HoodII，Bio－Rad Laboratories)，pH 計(jì)等.

1.2.2 試劑及藥品 CTAB、異戊醇、DNA Marker(1kb)、瓊脂糖，Tris、EDTA、SDS、NaCl、異丙醇，RNase A、蛋白酶K，Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、MgCl2、dNTP mixture Solution、動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒SK8222、6×Loading Buffer、dd Water(生工生物工程(上海)股份有限公司)，無(wú)水乙醇(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，苯酚、HCl(武漢市中天化工有限責(zé)任公司)、氯仿(武漢市江北化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)、NaOH(武漢中南化工試劑有限公司)，COI引物 LCO 1490、HCO 2198，EB(BIO－BASIC INC).

1.2.3 試劑配制 SDS 提取液(50 mmol/L EDTA，1%SDS，100mmol/L Tris－HCl，0.5 mol/L NaCl，PH8.0);1 mol/L Tris－HCl(PH8.0)500 mL，500 mmol/L EDTA(PH8.5)500 mL，TE 緩沖液(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris－HCl，PH8.0);蛋白酶 K(20 mg/mL，10 mg/mL);RNA 酶(10 mg/mL);20%SDS 溶液;5 mol/L NaCl溶液;STE 溶液(0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris－HCl(PH8.0);CTAB 提取液(2%CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，100mmol/L Tris－HCl(PH8.0))，50×TAE buffer(2mol/L Tris－醋酸，100mmol/L EDTA).

1.3 基因組DNA的提取方法

第一組選取大小、外形一致的完整搖蚊成蟲(chóng)數(shù)只，分別選取2只放入1.5 mL的離心管中，共裝4管，分別編號(hào)為1、2、3、4.第二組再另取4個(gè)1.5mL的離心管，每管裝入1只搖蚊，分別編號(hào)A、B、C、D，按照以下4種方法提取搖蚊基因組DNA.

1.3.1 動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒法(改良) 采用生工生物工程(上海)有限公司最新研制的動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒SK8222.取預(yù)處理過(guò)的搖蚊標(biāo)本，放到1.5 mL的離心管中，加入180 μL Buffer Digestion，用電動(dòng)研磨杵充分研磨，加入20 μL蛋白酶 K(10 mg/mL)，20 μL RNA酶，震蕩搖勻，56℃水浴過(guò)夜;加入200 μL Buffer PA，充分混合，置于－20℃冰箱放置5 min;將樣品于室溫下10000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移所得上清液(500～550μL)到已滅菌的新的1.5mL離心管中;加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置5 min，室溫10000r/min離心5min，棄上清;加入600μL 75%乙醇，顛倒漂洗1～3min，10000r/min離心2min，棄上清，重復(fù)此步驟一次;室溫開(kāi)蓋倒置5～10 min，至沒(méi)有明顯的乙醇?xì)馕都纯?得到的DNA用25 μL TE Buffer溶解.提取的DNA置于－20℃保存.

1.3.2 改良的SDS法 參考王茜［9］提取搖蚊基因組DNA的方法.取預(yù)處理過(guò)的搖蚊標(biāo)本，加100 μL SDS提取液，用電動(dòng)研磨杵研碎，后用500 μL提取液沖洗槍頭;加20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，20 μL RNA酶，混勻后置于56℃水浴過(guò)夜(時(shí)間充裕的話(huà)每隔20～30 min在漩渦混合器上混合30 s);加300 μL Tris飽和酚、300 μL氯仿:異戊醇(24∶1)，抽提DNA，12000r/min離心10min，取上清;加入與上清等體積的氯仿:異戊醇(24∶1)，12000 r/min離心10 min，取上清;加等體積的異丙醇于－20℃中沉淀DNA 2～3 h，12000 r/min離心15 min，棄上清;加600 μL 70%乙醇，洗滌DNA，12000 r/min離心15 min，棄上清，重復(fù)此步驟1次;濃縮干燥后加25 μL TE，溶解DNA，置于4℃保存?zhèn)溆?

1.3.3 改良CTAB法 參考王茜［9］提取搖蚊基因組DNA的方法.取預(yù)處理過(guò)的搖蚊，加100 μL CTAB提取液，用電動(dòng)研磨杵研碎，后用500 μL提取液沖洗槍頭;加20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、20 μL RNA酶，混勻后置于56℃水浴過(guò)夜(時(shí)間充裕的話(huà)每隔20～30min在漩渦混合器上混合30s);加300μL Tris飽和酚、300μL氯仿:異戊醇(24∶1)，抽提DNA，12000 r/min離心10 min，取上清;加入與上清等體積的氯仿:異戊醇(24∶1)，12000 r/min離心10 min，取上清;加等體積的異丙醇于－20℃中沉淀DNA 2～3 h，12 000 r/min離心15 min，棄上清;加600 μL 70%乙醇，洗滌DNA，12000 r/min離心15 min，棄上清，重復(fù)此步驟1次;濃縮干燥后加25 μL TE，溶解DNA，置于4℃保存?zhèn)溆?

1.3.4 改良NaCl法 參考王茜［9］提取搖蚊基因組DNA的方法.取預(yù)處理過(guò)的搖蚊，加200 μL STE，用電動(dòng)研磨杵研碎;加45～50μL SDS，4～5μL RNA 酶，37℃消化1h;加蛋白酶K 4～5μL(20mg/mL)，56℃消化過(guò)夜;加5mol/L NaCl 300μL，在漩渦混合器上高速混合30s，10000r/min離心30min，取上清;加等體積的異丙醇于－20℃中沉淀 DNA 2 h，10000 r/min 離心15 min，棄上清;加600 μL 70%乙醇，洗滌 DNA，12000 r/min 離心15 min，棄上清，重復(fù)此步驟1次;濃縮干燥后加25 μL TE，溶解DNA，置于4℃保存?zhèn)溆?

1.4 基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

觀察每種處理的DNA沉淀的性狀.在微量紫外分光光度計(jì)上做DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量分析;然后進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè).

1.4.1 微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度 吸取2 μL樣品DNA溶液，直接滴在微量紫外分光光度計(jì)的上樣孔處，在蛋白核酸分析儀上測(cè)定其在260 nm和280 nm處的消光值(OD值).通過(guò)OD260/OD280的比值計(jì)算DNA樣品的純度.

1.4.2 PCR－COI 以L(fǎng)CO 1490、HCO 2198作為引物，搖蚊基因組DNA為模板對(duì)搖蚊COI基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為 25 μL.其中 10×PCR buffer 2.5 μL，LCO primer 0.5 μL ，HCO primer 0.5 μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，MgCl22.0μL，Taq DNA polymerase 0.15μL，搖蚊 DNA 1.0μL，dd water 17.85μL.PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共24 cycles;最后72℃延伸5 min，7℃保存.

1.4.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 配置濃度為l%的瓊脂糖凝膠50 mL，加熱直至完全溶解.待膠冷卻至60℃左右時(shí)，將膠倒入膠槽中，常溫下冷卻10～20 min左右，使膠凝固后拔去梳子將其推入裝有1×TAE的電泳槽中，膠孔朝向負(fù)極，液面約淹沒(méi)膠面1mm左右.將6×Loading Buffer 1μL與5μL的PCR擴(kuò)增樣品用移液搶充分混勻，第一孔點(diǎn)入 2 μL DNA Marker，第二孔點(diǎn)入5μL混勻的DNA樣品，而后在輸出電壓80V下電泳45min最后在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果并照相.

表1 第1組編號(hào)1、2、3、4樣品DNA的OD值及檢測(cè)濃度Tab.1 OD values and detective density of No.1，2，3，4 DNA samples of group I

2 結(jié)果及分析

2.1 紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)

第1組中每個(gè)樣品檢測(cè)兩次取平均值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 1.一般認(rèn)為，OD260/OD280值在1.6～1.8時(shí)DNA較純;大于1.8，說(shuō)明樣品中 RNA未除盡;小于1.6，說(shuō)明樣品中含有蛋自質(zhì).從檢測(cè)結(jié)果可以看出，這4種方法均可獲得一定量的DNA，但是不同方法提取的DNA質(zhì)量有明顯差異，見(jiàn)表1.前三種方法所提取的DNA比值都大于1.8，說(shuō)明所獲得的DNA中遺留有較多RNA.而NaCl法提取的DNA比值低于1.6，說(shuō)明所測(cè)DNA樣品中蛋白質(zhì)未除盡.前三種方法中SDS法所得樣品OD260/OD280比值最接近1.8，說(shuō)明此法獲得的DNA相對(duì)于其他方法純度更高一些.在所測(cè)DNA樣品濃度一欄中，可知濃度由高到低依次為試劑盒法、CTAB法、SDS法、NaCl法.

第2組每個(gè)樣品檢測(cè)三次取平均值.其結(jié)果見(jiàn)表2.由下表可知，只有SDS法所得DNA A260/A280值平均值在1.6～1.8，說(shuō)明所得 DNA 純度較高，試劑盒法、CTAB法中比值皆大于1.8，說(shuō)明有大量 RNA存在，NaCl法所得明顯小于1.6，說(shuō)明其中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì).但CTAB法所得DNA濃度最高，其后為試劑盒法，SDS法，NaCl法所得依然最少.

第1組每個(gè)離心管中DNA樣品由2只搖蚊所提取得到，第2組每個(gè)離心管中DNA樣品由1只搖蚊所提取得到，從表3可看出試劑盒法和SDS法所提DNA兩組比例接近2∶1，符合所用樣品的數(shù)量比，而CTAB法兩組比例接近1∶1，NaCl法中第2組濃度甚至大于第1組.

2.2 電泳法檢測(cè)結(jié)果

電泳結(jié)果見(jiàn)圖1.第一組4個(gè)樣品編號(hào)為 1、2、3、4，第二組 4 個(gè)樣品編號(hào)為A、B、C、D，分別依次用試劑盒法、SDS法、CTAB法、NaCl法提取DNA;從圖1可知，4種方法均可提取出DNA.DNA Marker與擴(kuò)增片度都有一定的拖尾現(xiàn)象，這可能部分原因與電泳條件和瓊脂糖凝膠有關(guān)，除此之外，基于不同DNA提取方法的拖尾現(xiàn)象有不同程度的差異，如第一組CTAB法和SDS法提取的DNA條帶窄小但清楚、完整，推測(cè)這兩種方法所提DNA完整且純度較高，表1數(shù)據(jù)顯示試劑盒法提取DNA純度也較高，但顯示拖尾，推測(cè)DNA有斷裂現(xiàn)象;而NaCl法所提取的DNA條帶相對(duì)拖尾明顯，根據(jù)表1顯示該方法提取DNA純度不高，推測(cè)主要可能因含有較多雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等導(dǎo)致其純度不高.第2組中，試劑盒法、SDS法、CTAB法所得條帶都較明亮但皆有拖尾現(xiàn)象，又因依據(jù)表2，這三種方法提取DNA純度較高，推測(cè)拖尾現(xiàn)象可能因DNA斷裂引起或由于第二組選取樣品種類(lèi)不同導(dǎo)致COI引物特異性不同;NaCl法條帶模糊，無(wú)拖尾現(xiàn)象，推測(cè)COI引物在該種中特異性較高.

綜合以上分析可知，提取搖蚊基因組DNA的方法中，依據(jù)紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)結(jié)果，得到產(chǎn)物純度由高到低依次為SDS法、試劑盒法、CTAB法、NaCl法，濃度由高到低依次為試劑盒法、CTAB法、SDS法、NaCl法.綜合考慮，提取搖蚊基因組DNA的最佳方法是試劑盒法，其次為CTAB法和SDS法.依據(jù)電泳法檢測(cè)結(jié)果得出，4種方法提取的DNA的濃度都能擴(kuò)增出特異的COI基因片段.

表2 第2組編號(hào)A、B、C、D樣品DNA的OD值及檢測(cè)濃度Tab.2 OD values and detective density of No.A，B，C，D DNA samples of group II

表3 第1組、第2組所得DNA樣品濃度比較Tab.3 The comparison of DNA sample’s density of group I between group II

圖1 PCR－COI瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The picture of agarose gel electrophoresis of PCR results

3 討論

本研究用4種方法提取搖蚊基因組DNA濃度和純度的比較主要依據(jù)第1組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(表1)，因?yàn)樵摻M選取的4種樣品來(lái)自同一采集地和采集時(shí)間的婚飛群體，即同一物種，具有較好的可比性;第2組選取的4個(gè)樣品個(gè)體大小、形態(tài)特征明顯不同，通過(guò)該組的數(shù)據(jù)(表2)進(jìn)一步驗(yàn)證了4種方法提取的DNA的純度高低與第1組結(jié)論一致，但該組數(shù)據(jù)得出的濃度無(wú)可比性.

本研究，第1組每個(gè)樣品選取了2頭搖蚊，第2組每個(gè)樣品選取1頭搖蚊，個(gè)體大小、數(shù)量與DNA濃度有一定的相關(guān)性，因此兩組的DNA濃度進(jìn)行了進(jìn)一步比較，見(jiàn)表3，根據(jù)選取個(gè)體數(shù)量不同，第1組(2頭標(biāo)本)濃度應(yīng)高于第2組(1頭標(biāo)本)，甚至第1組濃度可能為第2組的2倍.但由表3可知，只有試劑盒法和SDS法符合這個(gè)比例，CTAB法和NaCl法都存在反常情況，分析原因可能是由于選材時(shí)由于存在種類(lèi)差異的所造成的:第1組選材時(shí)特別注重了選取同一種類(lèi)，以便減少誤差，突出提取方法的差異;而第2組選材時(shí)，一方面是受到實(shí)驗(yàn)材料的限制，造成選取種類(lèi)大小不一，另一方面是為了驗(yàn)證搖蚊個(gè)體大小差異對(duì)DNA提取濃度或純度的影響.

本實(shí)驗(yàn)采用的方法皆在多次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做過(guò)改良，其中試劑盒采用生工生物工程(上海)有限公司最新研制的動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒SK8222，本研究過(guò)程中利用該試劑盒做過(guò)多次嘗試，都未能提取到理想的DNA條帶.因此將原方法的65℃水浴1～3 h改為56℃水浴過(guò)夜，使組織徹底裂解釋放出DNA，而對(duì)于是否額外添加蛋白酶K則可視具體實(shí)驗(yàn)要求添加而不會(huì)對(duì)提取DNA造成大的影響，第1組試劑盒方法中額外添加蛋白酶K，而第2組試劑盒方法中按照標(biāo)配操作，未額外加蛋白酶K;同時(shí)為了保證提取DNA的濃度，在溶解時(shí)改為用25 μL TE Buffer溶解.其他幾種方法參考王茜［9］的論文，同樣經(jīng)過(guò)筆者多次實(shí)驗(yàn)探究都未能獲得理想結(jié)果，因此在原方法(水浴2～3 h)的基礎(chǔ)上采用水浴過(guò)夜處理，過(guò)夜水浴加長(zhǎng)了裂解時(shí)間，能夠使樣品充分裂解，有利于釋放DNA，同時(shí)加大了蛋白酶K的用量，有利于消除蛋白質(zhì)對(duì)于DNA提取的影響.

本實(shí)驗(yàn)采用搖蚊COI引物對(duì)搖蚊COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后再用瓊脂糖電泳檢測(cè)，一方面可以對(duì)所提DNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，另一方面也為分子生物學(xué)所用到的基因片段后續(xù)工作打好基礎(chǔ).

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