螯合劑和AM菌根對玉米吸收重金屬及重金屬化學形態(tài)的影響

李瑞，劉曉娜，趙中秋,

1. 中國地質大學（北京）土地科學技術學院，北京 100083；2. 國土資源部土地整治重點實驗室, 北京 100035

土壤重金屬污染已成為全球普遍關注的環(huán)境問題之一。土壤―植物系統(tǒng)是地圈及生物圈基本構成單位，重金屬污染不僅對農作物的收成與質量有重要影響，而且還影響到大氣及水環(huán)境質量，甚至通過食物鏈危及人類健康（Chen等，2000；Cunningham等，1995；Khan等，2000；Karenlampi等，2000）。較之傳統(tǒng)的物理、化學修復技術，植物修復因其效果好、投資省、易于管理和操作、不產生二次污染等優(yōu)點日益受到人們的重視（Baker和 Brooks，1989；Salt等，1995），被學術界公認為生態(tài)友好型原位綠色修復技術，成為污染土壤修復研究的熱點（Salt等，1998；Garbisu和Alkorta，2001）。近年來，國內外對金屬螯合劑在化學―植物聯(lián)合修復和菌根菌在微生物―植物聯(lián)合修復中的應用開展了大量的研究。

螯合劑能夠促進重金屬從土壤固相解吸，增加重金屬離子的生物有效性，促進植物對重金屬元素的吸收。但螯合劑和金屬螯合物會抑制植物的生長，使其生物量減少，甚至死亡（Blaylock等，1997），大大影響植物提取的效率。AM菌根菌是一類能與絕大多數(shù)陸生植物形成互惠共生關系的土壤真菌，能積極促進宿主植物吸收礦質營養(yǎng)和抵抗逆境脅迫（Powell和Bagyaraj，1984）。研究表明，AM真菌能夠顯著增強植物對許多重金屬的耐受能力，在重金屬污染土壤的植物修復中表現(xiàn)出積極的意義（Hildebrandt等，2007）。若螯合劑和菌根組合應用，理論上應該可以發(fā)揮二者的優(yōu)勢，大大提高植物提取效率。根際是受植物根系活動影響的部分土壤，是一種微生態(tài)系統(tǒng)。根際土壤環(huán)境影響著重金屬在土壤―植物系統(tǒng)中的遷移和轉化（Marschner，1986；Yossefu等，1997），而重金屬形態(tài)與其遷移、轉化和生物有效性有著密切的關系。了解菌根對根際土壤中重金屬形態(tài)變化的影響，對發(fā)展重金屬污染修復技術有著重要的意義，目前相關研究很少。本文通過土培實驗，比較研究EDTA、EDDS、AES、IDSA和AM菌根單一或復合添加對玉米Zea maysL.生物量及土壤中重金屬質量分數(shù)的影響，闡明新型螯合劑在修復重金屬污染土壤方面的潛力及AM和螯合劑聯(lián)合能否達到理論上的強化效果，并分析玉米菌根根際重金屬的形態(tài)變化，以了解AM菌根對根際和非根際土壤中重金屬化學形態(tài)的影響，為重金屬污染土壤修復提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤采自北京市昌平區(qū)農田，實驗用玉米品種為魯單 981，菌根由北京市林業(yè)科學院提供，經玉米擴繁后，用含有侵染菌根和菌絲的根際土壤作為菌根接種劑。螯合劑EDDS購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。土壤理化性質的測定參照魯如坤的方法（魯如坤，2000），結果見表1。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Basic Physicochemical characteristics of soils

1.2 盆栽實驗

實驗采用的三室根箱裝置寬8 cm，長、高10 cm，中室寬2 cm，2個邊室各3 cm，中室和邊室用30 μm孔徑的尼龍網(wǎng)相隔，把根系限制在中室生長。邊室土量250 g，中室土量200 g，將30 g接種劑和170 g滅菌后的土壤混合裝入中室，菌種接種率為15%，對照處理加入相應數(shù)量的經滅菌處理后的接種劑。保持田間持水量為80%左右，在溫室中平衡2周。

土壤自然風干后，將土壤樣品磨碎，過1 mm篩，在120 ℃高溫滅菌鍋中滅菌2 h，殺死土壤中的真菌孢子，待滅菌土壤自然風干后，一次性添加Pb、Cu、Cd、Zn 4 種重金屬：2000 mg·kg-1Pb（PbCl2），350 mg·kg-1Cu(CuSO4·5H2O)，10 mg·kg-1Cd （ CdCl2·2.5H2O ） ， 1500 mg·kg-1Zn（ZnSO4·7H2O），并以磷酸二氫鉀（KH2PO4）、尿素（CO(NH2)2）形式一次性施入基肥（氮：100 mg·kg-1；磷：80 mg·kg-1；鉀 100 mg·kg-1）。選取籽粒飽滿的玉米種子用10%的H2O2溶液消毒10 min，用去離子水洗凈后，將種子放于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放在25 ℃左右培養(yǎng)箱約2 d，將發(fā)芽的種子播種于三室根箱的中室，待種子萌發(fā)后間苗，每箱留2株，生長期間每隔1 d以稱質量法加去離子水使土壤保持田間持水量的80%左右。待幼苗生長50 d后進行螯合劑處理，EDTA、EDDS、AES和IDSA分別配成溶液一次性均勻淋溶在土壤表面。實驗中所添加的螯合劑質量摩爾濃度為 5 mmol·kg-1。實驗共設計 10個處理，分別記為 CK（未添加螯合劑和菌土）、AM（只添加菌土）、EDTA（只添加螯合劑 EDTA）、EDDS（只添加螯合劑EDDS）、AES（只添加螯合劑AES）、IDSA（只添加螯合劑IDSA）、EDTA&AM（同時添加EDTA和AM）、EDDS&AM（同時添加 EDDS和 AM）、AES&AM（同時添加AES和AM）和IDSA&AM（同時添加IDSA和AM），每個處理設置4個重復，隨機區(qū)組排列。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 植物分析

螯合劑處理15 d后收獲，用剪刀沿植株基部切取，分為根部和地上部。將根系用去離子水洗干凈后，每個處理的每個重復挑選20個1 cm左右長的鮮根，用墨水醋方法測定菌根侵染率（楊亞寧等，2010），菌根侵染率=（被侵染的根段數(shù)/總根段數(shù)）×100%。剩余根部和地上部用去離子水洗凈后80 ℃烘干并稱干質量，烘干后的樣品研碎后用HNO3微波硝煮，同時加入標準物質對整個消化過程和分析測試過程進行質量控制，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES，Varian 715-ES Series）測定重金屬的質量分數(shù)。

1.3.2 重金屬化學形態(tài)分析

根箱內的土壤分為兩部分處理，中室土和邊室中距離尼龍網(wǎng)5 mm以內的土作為根際土，邊室中剩余土壤作為非根際土，將兩部分土自然風干后過（相當于100目）篩待用。采用改進的BCR三步法（Rauret等，1999；Filgueiras等，2002）分析土壤中Pb、Cu、Zn和Cd的形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003繪圖，SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理及顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 不同處理對菌根侵染率的影響

圖1 接種AM處理組間菌根侵染率的比較Fig.1 Mycorrhizal colonization at different chelator treats

由圖1可見，對照組無菌根侵染，而接種AM菌根組都有較高的侵染率，表明AM菌根在重金屬環(huán)境中可以正常地生長，對土壤中重金屬的毒害具有一定的耐性，這樣AM菌根才有發(fā)揮作用的可能。與單一接種AM菌根的對照相比，復合施加螯合劑EDTA和 AES的處理組菌根侵染率明顯降低（P<0.05），而復合施加EDDS和IDSA的處理組無顯著性變化，這可能與不同種類螯合劑和菌根之間存在不同程度的相互作用有關，EDDS和IDSA均為生物可降解螯合劑，對土壤生物的毒害較小。

2.2 不同處理對玉米地上部生物量的影響

如圖2所示（不同字母表示差異顯著，P<0.05），與對照相比，添加螯合劑對植物的生長有一定的限制，地上部生物量都有所下降，其中，添加EDDS和IDSA的處理組與對照差異顯著（P<0.05），有明顯的中毒癥狀，主要表現(xiàn)為部分葉片萎蔫。螯合劑提高了土壤中重金屬的生物有效性，促進了植物對重金屬的吸收，過量的重金屬對植物生長產生抑制作用。

單獨添加AM菌根的處理組與對照相比玉米地上部生物量顯著增加（P<0.05），玉米地上部生物量分別為3.16 g、2.55 g，前者比后者增加了24%。復合添加螯合劑和AM菌根的處理組與單獨添加螯合劑的處理相比較，前者大于后者，但差異不顯著。

2.3 不同處理對玉米地上部和根部重金屬質量分數(shù)的影響

圖2 不同處理對玉米地上部生物量的影響Fig.2 Effects of different treats on maize shoot biomass

2.3.1 Cd質量分數(shù)變化

如圖3所示，對于玉米地上部，對照組與單獨接種 AM 處理組玉米地上部 Cd質量分數(shù)分別為2.11、17.42 mg·kg-1，后者比前者增加了194.3%，達到顯著性差異水平（P<0.05）。對照組與單獨添加螯合劑的處理組相比，除EDDS處理外，EDTA、AES和IDSA處理的玉米地上部Cd質量分數(shù)分別是對照的3.6倍、6.2倍和6.3倍，說明接種AM菌根和添加螯合劑均促進了玉米地上部對Cd的吸收。AM&EDDS處理較之 EDDS處理，前者是后者的6.4倍，較之單獨接種 AM 處理增加了 120.7%。AM&IDSA處理較之IDSA處理和單獨接種AM處理也得到類似結果，表明復合添加螯合劑和AM增強了玉米地上部吸收積累Cd的效果。

對于玉米根部，單一接種AM菌根的處理組玉米根部Cd質量分數(shù)達到43.88 mg·kg-1，是對照的5.9倍，達到顯著性差異水平（P<0.05）。單一添加EDTA、EDDS的處理組，玉米根部Cd質量分數(shù)分別為 40.89 mg·kg-1和 30.22 mg·kg-1，是對照的 5.5倍和4.0倍，差異顯著（P<0.05），說明接種AM菌根和螯合劑的添加促進了玉米根部對Cd的吸收。單一接種AM處理的玉米根部和地上部Cd質量分數(shù)均顯著大于對照（P<0.05）；EDTA與AM&EDTA比較，玉米根部 Cd質量分數(shù)前者顯著大于后者（P<0.05），而地上部 Cd質量分數(shù)無顯著差異；EDDS較之AM&EDDS，玉米根部Cd質量分數(shù)前者大于后者，地上部Cd質量分數(shù)則相反；IDSA和AM&IDSA比較，玉米根部Cd質量分數(shù)無明顯差異，但地上部Cd質量分數(shù)后者顯著大于前者，這些表明接種AM菌根促進了Cd由根部向地上部的轉移。

圖3 不同處理對玉米根部和地上部Cd質量分數(shù)的影響Fig.3 Cd concentrations in the shoots and roots of maize at different treats

圖4 不同處理對玉米根部和地上部Zn質量分數(shù)的影響Fig.4 Zn concentrations in the shoots and roots of maize at different treats

2.3.2 Zn質量分數(shù)變化

如圖4所示，對于玉米地上部Zn的質量分數(shù)，單獨接種AM處理與對照無顯著性差異。除EDTA外，單獨添加EDDS、AES和IDSA處理的玉米地上部 Zn質量分數(shù)較之對照分別增加了 49.7%、159.1%和53.4%，表明添加螯合劑促進了植物地上部對Zn的吸收，且AES影響最大。復合添加螯合劑和 AM 的處理較之單一添加螯合劑的處理組相比，除AM&IDSA相對IDSA顯著降低外（P<0.05），其他組處理無顯著性差異；除 AM&EDTA外，AM&EDDS、AM&AES和AM&IDSA處理組顯著高于單一接種 AM 菌根處理（P<0.05），分別增加了49.4%、134.1%和21.8%，表明螯合劑和AM的復合添加增強了單一接種AM菌根對玉米地上部吸收Zn的效果。

對于玉米根部，單獨接種AM菌根處理的玉米根部Zn質量分數(shù)顯著大于對照（P<0.05），增加了34.9%。單獨添加EDTA、EDDS、AES和IDSA的處理與對照相比，分別增加了110.0%、73.3%、63.8%和60.0%，說明接種AM菌根和添加螯合劑都促進了玉米根部對 Zn的吸收。AM&EDDS處理較之EDDS處理，前者比后者增加了48.6%，AM&AES處理較之 AES處理玉米根部 Zn質量分數(shù)增加了24.6%。復合添加螯合劑和AM處理與單一接種AM處理相比，AM&IDSA與 AM 無顯著性差異。AM&EDTA、AM&EDDS和AM&AES較之AM處理分別增加了 70.0%、90.9%和 51.3%，差異顯著（P<0.05）。以上表明復合添加螯合劑和AM菌根增強了單一添加AM或者螯合劑對玉米根部吸收積累Zn的效果。

2.3.3 Cu質量分數(shù)變化

如圖5所示，對于玉米地上部，單獨接種AM處理的玉米地上部Cu質量分數(shù)相對于對照增加但差異性不顯著。除EDTA外，單獨添加EDDS、AES和IDSA處理組玉米地上部Cu質量分數(shù)均顯著大于對照（P<0.05），分別是對照的9.4倍、21.8倍和7.7倍，表明螯合劑增加了玉米地上部對Cu的吸收。復合添加螯合劑和 AM 菌根處理，除 AM&EDTA外，AM&EDDS、AM&AES和AM&IDSA處理玉米地上部Cu質量分數(shù)顯著大于單獨添加AM處理（P<0.05），前者分別是后者的5.4倍、8.4倍和3.3倍。復合添加螯合劑和AM增強了單一接種AM玉米地上部對Cu的吸收。

圖5 不同處理對玉米根部和地上部Cu質量分數(shù)的影響Fig.5 Cu concentrations in the shoots and roots of maize at different treats

對玉米根部，單獨接種AM處理玉米根部Cu質量分數(shù)與對照沒有顯著性差異。單獨添加EDTA、EDDS、AES和IDSA的處理玉米根部Cu質量分數(shù)與對照相比有顯著性差異（P<0.05），前者分別比對照增加了102.3%、91.3%、229.1%和131.0%，表明螯合劑增加了玉米根部對Cu的吸收。復合添加螯合劑和AM處理較之單獨接種AM處理，前者玉米根部Cu質量分數(shù)顯著大于后者（P<0.05），分別是后者的2.6倍、1.8倍、4.0倍和1.6倍，說明復合添加螯合劑和AM促進了單一接種AM對玉米根部吸收Cu的效果。

2.3.4 Pb質量分數(shù)變化

如圖6所示，對于玉米地上部Pb的質量分數(shù)，單一接種AM處理與對照無顯著性差異。單獨添加EDTA、EDDS、AES和IDSA處理組顯著大于對照（P<0.05），分別是對照的3.4倍、9.1倍、8.6倍和8.1倍，表明螯合劑促進了玉米地上部對Pb的吸收。復合添加螯合劑和AM處理與單一接種AM處理比較，前者顯著大于后者（P<0.05），分別是后者的3.3倍、5.5倍、11.9倍和8.7倍。AM&AES處理較之AES處理，前者比后者增加了71.5%。AM&IDSA處理較之IDSA處理，前者比后者增加了32.0%。AM&EDTA處理與EDTA處理差異不顯著。這些說明，復合添加螯合劑和菌根增強了單一接種AM或單一添加螯合劑玉米地上部對Pb的吸收效果。

對于玉米根部 Pb的質量分數(shù)，單獨接種 AM處理組與對照沒有顯著性差異。單獨添加EDTA、EDDS、AES和 IDSA處理組都顯著大于對照（P<0.05），分別是對照的5.0倍、4.7倍、2.8倍和1.9倍，表明螯合劑促進了玉米根部對Pb的吸收。復合添加螯合劑和AM處理組與單獨接種AM處理組相比，AM&IDSA與單一接種AM處理無顯著性差異，AM&EDTA、AM&EDDS和AM&AES與單獨接種AM處理相比，前者顯著大于后者（P<0.05），分別是后者的4.5倍、4.2倍和2.8倍。以上表明復合添加螯合劑和AM增強了單一接種AM玉米根部對Pb的吸收效果。

2.4 AM 菌根對根際和非根際土壤重金屬化學形態(tài)的影響

重金屬的生物毒性不僅由其總量決定，更大程度上由其形態(tài)分布決定，不同的形態(tài)產生不同的環(huán)境效應（張旭紅等，2012）。在研究菌根能夠提高宿主植物對重金屬抗性的影響機理時，有些研究認為菌根真菌的菌絲在植物根的表皮形成一個很大的網(wǎng)絡（哈蒂氏網(wǎng)），這些哈蒂氏網(wǎng)帶可以吸收過濾重金屬，阻止重金屬向根部運輸，從而減輕重金屬對植物的毒害（Turnau等，2001）；研究認為菌根侵染的根系改變了土壤中重金屬的形態(tài)，影響了重金屬的生物有效性（黃藝等，2000）。以根際土壤中重金屬的不同形態(tài)相對于非根際土壤中重金屬形態(tài)的增加百分率為相對改變量，其中Cd的相對變化由于儀器的限制沒有檢測出來。圖7顯示了Zn、Cu和Pb在菌根根際土壤和非菌根根際土壤中重金屬形態(tài)的不同變化情況。

在菌根根際土壤與非菌根根際土壤中，菌根根際相對于非根際Zn的Fe-Mn氧化物結合態(tài)的減少量顯著小于非菌根根際相對于非根際土壤的相對減少量（P<0.05），表明菌根根際中Zn的Fe-Mn氧化態(tài)較非菌根根際顯著增加。菌根根際中 Zn的有機物結合態(tài)顯著高于非菌根根際（P<0.05），Zn的Fe-Mn氧化態(tài)和有機物結合態(tài)呈現(xiàn)增加的趨勢，降低了 Zn的生物有效性，減少了過量重金屬對植物的毒害。在前文中提到單一接種AM處理的玉米根部Zn質量分數(shù)顯著大于對照，雖然接種AM降低了 Zn的生物有效性，但促進了植物的生長，植物吸收的Zn總量仍會大于非菌根，可能與Zn是植物必需的微量元素有關。相對于非根際土壤，Cu的酸可提取態(tài)在菌根根際中減少，在非菌根根際中增加，表示菌根根際中酸可提取態(tài)的Cu小于非菌根根際。菌根根際中Cu的有機物結合態(tài)大于非菌根根際，Cu的生物有效性小于非菌根根際，菌根降低了重金屬Cu的生物可利用性，緩解了過量重金屬對植物的負作用。在前文中提到單一接種AM處理的玉米根部Cu質量分數(shù)與對照無顯著性差異，這種情況可能與Cu是植物必需的微量元素有關。菌根根際土壤中 Pb的酸可提取態(tài)大于非菌根根際，F(xiàn)e-Mn有機物結合態(tài)和有機結合態(tài)大于非菌根根際，但菌根根際中的 Pb由松結合態(tài)向緊結合態(tài)轉移的趨勢大，使得菌根根際中 Pb的有效性下降，降低了重金屬對植物的毒害。

圖7 不同形態(tài)重金屬在菌根和非菌根根際中的相對變化Fig. 7 Relative change of different speciation of heavy metals in mycorrhizal and non-mycorrhizal rhizosphere

3 結論與展望

3.1 研究結論

通過不同種類螯合劑和菌根對植物吸收重金屬的影響實驗、菌根對根際和非根際土壤中重金屬存在形態(tài)的影響實驗，可以得到以下結論：

（1）螯合劑EDTA、EDDS、AES和IDSA促進了植物對重金屬的吸收，但螯合劑及重金屬螯合物對植物的生長產生抑制作用。AM菌根可以促進植物的生長，增強植物對重金屬環(huán)境的抗性，并且一定程度上促進了植物對Cd和Zn的吸收。復合添加螯合劑和接種AM菌根能夠提高單一接種AM菌根或者添加螯合劑時玉米對重金屬的吸收積累量，兩者聯(lián)合強化了單一應用AM或螯合劑誘導植物提取的效果。

（2）新型螯合劑AES和IDSA處理的玉米地上部 Cd質量分數(shù)顯著大于對照、EDTA和 EDDS（P<0.05）。AES處理玉米地上部Zn、Cu和Pb的質量分數(shù)均顯著大于對照及其他螯合劑處理，但EDTA處理的玉米根部Pb質量分數(shù)最大。IDSA處理玉米地上部Zn質量分數(shù)，地上部和根部Cu質量分數(shù)均顯著大于對照和EDTA，玉米地上部Pb質量分數(shù)顯著大于對照。

（3）接種AM菌根改變了根際土壤中重金屬的形態(tài)，菌根的存在使得重金屬的形態(tài)由松結合態(tài)向緊結合態(tài)轉移，降低了重金屬的生物有效性，降低了過量重金屬對宿主植物的毒害。但是，可能由于菌根對植物的生長有促進作用，提高了植物對重金屬的吸收效率，接種AM菌根的植物積累的重金屬總量大于非菌根，AM菌根增強了植物提取的效果。

3.2 研究展望

首先，新型螯合劑AES和IDSA對Pb的作用不及EDTA，有待繼續(xù)尋找對Pb解吸能力更強的新型生物可降解螯合劑。其次，對于螯合劑和AM菌根強化植物提取的研究還需要大量的田間試驗分析，得出對實際應用價值更高的組合配比。再次，在應用螯合劑誘導植物提取時，植物收割后土壤中重金屬的質量分數(shù)還是比較高，要綜合考慮植物種類和種植制度。最后，不是所有的植物都能形成菌根，這就使得菌根植物對重金屬污染土壤的修復受到限制，菌根修復技術還需與生物學、植物學、微生物學等學科相互滲透，提高植物?微生物修復技術的應用價值。

致謝：本實驗在中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心中澳土壤環(huán)境研究室完成，感謝朱永官研究員、黃益宗副研究員在實驗過程中給予的指導和幫助。

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