固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法和快速紙片法測(cè)定水中糞大腸菌群 (耐熱大腸菌群)的比較

朱培瑜，魏 軻

(無(wú)錫市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，江蘇無(wú)錫 214121)

目前水中糞大腸桿菌群 (耐熱大腸菌群)檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的濾膜法及多管發(fā)酵法，并且已經(jīng)列入環(huán)保行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法 (HJPT 347－2007)，此兩種傳統(tǒng)方法被國(guó)內(nèi)環(huán)境檢測(cè)部門(mén)廣泛采用，但上述方法操作時(shí)間需2～5天，步驟較為繁瑣，需驗(yàn)證試驗(yàn)，不能對(duì)水的衛(wèi)生學(xué)狀況做出快速評(píng)價(jià)，制約了其應(yīng)用［1］。快速紙片法是《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)中的C類(lèi)推薦方法，操作步驟比較簡(jiǎn)單，無(wú)需驗(yàn)證試驗(yàn)，但此方法同樣不能對(duì)水的衛(wèi)生學(xué)狀況做出快速評(píng)價(jià)，并且此方法更適用于生活污水或相關(guān)工業(yè)廢水的監(jiān)測(cè)。酶底物法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，并可檢測(cè)有病原學(xué)意義的大腸埃希氏菌 (E.coli.)，已經(jīng)在美、日、韓和歐洲許多國(guó)家使用。我國(guó)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》與世界接軌，已經(jīng)增加大腸埃希氏菌的檢測(cè)，作為評(píng)價(jià)飲用水水質(zhì)的指標(biāo)。因此，有必要開(kāi)展酶底物法檢測(cè)環(huán)境水樣的大腸埃希氏菌，并檢測(cè)糞大腸菌群，通過(guò)其與多管發(fā)酵法及快速紙片法的結(jié)果比對(duì)，建立新的評(píng)價(jià)指標(biāo)，找出替代多管發(fā)酵法的簡(jiǎn)單、快速方法［2］。

酶底物法 (enzyme substrate technique)采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β－半乳糖苷酶 (β－D－galactosidase)分解ONPG(Ortho－nitrophenyl－β－D－galactopyranoside)使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產(chǎn)生β－葡萄糖醛酸酶 (β－glucuronidase)分解MUG(4－methyl－umbelliferyl－β－D－glucuronide)使培養(yǎng)液在波長(zhǎng)366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的原理，來(lái)判斷水樣中是否含有大腸菌群、糞大腸菌群 (耐熱大腸菌群)及大腸埃希氏菌 。酶底物法可以采用成品的培養(yǎng)基及試劑，操作方便，無(wú)需確認(rèn)試驗(yàn)，酶底物法檢測(cè)時(shí)間較短，18～24h即可同時(shí)判斷水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值。在美國(guó)，歐洲及大部分亞洲國(guó)家廣泛應(yīng)用于水中總大腸桿菌，糞大腸菌群 (耐熱大腸菌群)及大腸埃希氏的檢測(cè)，并通過(guò)美國(guó)EPA，《水與廢水標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法》以及我國(guó)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》認(rèn)證［4］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)中酶底物法采用指定受檢物檢驗(yàn)技術(shù)(DST，defined substrate technology)，其 MMOMUG培養(yǎng)基、試驗(yàn)材料和儀器由愛(ài)德士公司提供，標(biāo)準(zhǔn)菌株采用ATCC 25922(大腸埃希菌)。其它所用培養(yǎng)基與試劑按《生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范》(2001版)和《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》 (第四版)準(zhǔn)備和配置。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多管發(fā)酵法和快速紙片法檢測(cè)水中糞大腸菌群方法參見(jiàn)《生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范》和《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)。

1.2.2 酶底物法檢測(cè)水中糞大腸菌群采用97孔定量盤(pán)法，此方法是一種基于MPN的方法。檢測(cè)所需水樣為100mL。用100mL的無(wú)菌取樣瓶量取100mL水樣，加入科立得TM(ColilertR)試劑，混搖均勻使之完全溶解，將水樣全部倒入97孔無(wú)菌定量盤(pán)內(nèi)，以手撫平定量盤(pán)背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后用封口機(jī)封口 。放入44.5℃ ±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行結(jié)果判讀，如果結(jié)果為可疑陰性，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到28h，超過(guò)28h之后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽(yáng)性結(jié)果［5］。將培養(yǎng)24 h之后的定量盤(pán)取出觀察，如果孔穴內(nèi)的水樣變成黃色則表示該孔穴中含有糞大腸菌群 (耐熱大腸菌群)。計(jì)算有黃色反應(yīng)的孔穴數(shù)，對(duì)照MPN表查出其代表的糞大腸菌群 (耐熱大腸菌群)最可能數(shù)。

1.2.3 采用無(wú)菌水和標(biāo)準(zhǔn)菌種ATCC 25922(大腸埃希菌)標(biāo)準(zhǔn)菌種檢驗(yàn)3種方法的假陽(yáng)性率與假陰性率:標(biāo)準(zhǔn)菌種ATCC 25922經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)后，采用無(wú)菌水稀釋?zhuān)?jīng)顯微鏡初步計(jì)數(shù)后，采用3種方法分別接種培養(yǎng)后，檢驗(yàn)MPN結(jié)果與顯微鏡技術(shù)結(jié)果有無(wú)差異。

1.2.4 數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)方法使用Excel和SPSS17.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 精密度檢驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)菌種ATCC 25922(大腸埃希菌)稀釋培養(yǎng)液，首先對(duì)酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法進(jìn)行平行雙樣的精密度檢驗(yàn)，結(jié)果3種方法平行雙樣的對(duì)數(shù)差值均小于該批數(shù)據(jù)的精密度判斷值3.27R。同時(shí)，采用標(biāo)準(zhǔn)菌種ATCC 25922(大腸埃希菌)稀釋培養(yǎng)液，進(jìn)行3種方法的定性確認(rèn)試驗(yàn)，結(jié)果3種方法未出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，即假陽(yáng)性率與假陰性率為0。

表1 試驗(yàn)水樣編號(hào)與水樣性質(zhì)Tab.1 Characters of different water samples in various testing water sample numbers

2.2 比對(duì)結(jié)果

為了檢驗(yàn)酶底物法在實(shí)際工作中的適用性，采集了污水、地表水、地下水等實(shí)際水樣進(jìn)行3種方法的比對(duì)試驗(yàn)。比對(duì)試驗(yàn)的水樣編號(hào)與水樣性質(zhì)見(jiàn)表1。

大腸菌群數(shù)據(jù)結(jié)果是由MPN值乘以稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算，因此大腸菌群數(shù)據(jù)往往是比較大的數(shù)值，為了便于查看比對(duì)結(jié)果，將本次進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)的50組數(shù)據(jù)結(jié)果取lg值來(lái)表示。3種方法監(jiān)測(cè)大腸菌群結(jié)果lgMPN值見(jiàn)圖1。

分別對(duì)3種方法所測(cè)得的大腸菌群的MPN結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，為了方便計(jì)算，所有的結(jié)果值以lg來(lái)計(jì)算。結(jié)果如表2～表4所示。

圖1 3種方法監(jiān)測(cè)大腸菌群結(jié)果比較Fig.1 Comparison of monitor results on coliforms with three methods

表2 酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法配對(duì)變量統(tǒng)計(jì)Tab.2 Variable statistics on pairing Enzyme substrate method，multi-tube fermentation method and rapid paper strip method

表3 酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法配對(duì)變量相關(guān)性統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics on pairing vaiable relevance of Enzyme substrate method，multi－tube fermentation method and rapid paper strip method

表4 酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Pairing t test results of Enzyme substrate method，multi－tube fermentation method and rapid paper strip method

2.2.1 多管發(fā)酵法－快速紙片法配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果

相關(guān)性系數(shù)r=0.963，可看出兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性很好，P=0，說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性趨于一致。配對(duì)t檢驗(yàn)，回歸分析結(jié)果表明，回歸系數(shù)t檢驗(yàn)t=1.884，P=0.066，P值大于0.05，即差異沒(méi)有顯著意義?？烧J(rèn)為多管發(fā)酵法與快速紙片法沒(méi)有區(qū)別，效果是相同的。

2.2.2 酶底物法－快速紙片法配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果

相關(guān)性系數(shù)r=0.954，可看出兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性很好，P=0，說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性趨于一致。配對(duì)t檢驗(yàn)，回歸分析結(jié)果表明，回歸系數(shù)t檢驗(yàn)t=1.575，P=0.122，P值大于0.05，即差異沒(méi)有顯著意義?？烧J(rèn)為酶底物法與多管發(fā)酵法沒(méi)有區(qū)別，效果是相同的。

2.2.3 酶底物法－多管發(fā)酵法配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果

相關(guān)性系數(shù)r=0.990，可看出兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性很好，P=0，說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性趨于一致。配對(duì)t檢驗(yàn)，回歸分析結(jié)果表明，回歸系數(shù)t檢驗(yàn)t=0.249，P=0.804，P值大于0.05，即差異沒(méi)有顯著意義?？烧J(rèn)為酶底物法與多管發(fā)酵法沒(méi)有區(qū)別，效果是相同的。

3 討論

3.1 酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法的檢測(cè)結(jié)果中快速紙片法MPN值略低，尤其是圖1中水樣25、水樣27、水樣41和水樣50，這是由于酶底物法和多管發(fā)酵法的培養(yǎng)基都是可溶性的，與接種水樣可充分混勻;而快速紙片法采用的是紙培養(yǎng)基，與接種水樣接觸只是浸潤(rùn)，難以達(dá)到混勻的效果，這也佐證了快速紙片法更適合生活污水和相關(guān)的工業(yè)廢水等大腸菌群數(shù)量較多的水樣。

3.2 由于多管發(fā)酵法每100mL水樣中最低檢出限為2個(gè)糞大腸菌群，而酶底物法卻能抑制200萬(wàn)個(gè)異樣細(xì)菌，精確檢測(cè)到1個(gè)糞大腸菌群，顯然酶底物法更適合糞大腸菌群含量較低的水樣。

3.3 酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法主要優(yōu)缺點(diǎn)比較，見(jiàn)表5。

表5 酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法主要優(yōu)缺點(diǎn)比較Tab.5 Comparison of the main advantages and disadvantages of the Enzyme substrate method，multi-tube fermentation method and the rapid paper strip method

［1］高瑞坤，湯 琳，傅 強(qiáng).水中糞大腸菌群快速檢測(cè)方法－固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法的比較［J］.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)，2008，24(4):39-41.

［2］趙春霞，張哲海，厲以強(qiáng)，等.酶底物法與多管發(fā)酵法和紙片法監(jiān)測(cè)環(huán)境水樣大腸菌群的比較［J］.環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2009，21(2):63-64.

［3］孫宗科，吳 榕，丁 培，等.水中在腸菌群快速檢測(cè)方法—酶底物法與多管發(fā)酵法的比較［J］.衛(wèi)生研究，2006，35(4):1-2.

［4］GBPT 5750.2007:13-2006.生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法［S］.

［5］Eaton，Andrew D(EDT)，etc.Standard Methods for Examination of Water＆ Wastewater［M］.USA:Amer Public Health Assn，2012.