利用16S rRNA 基因克隆文庫技術(shù)分析 德昌水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性

楊承劍，韋升菊，梁辛，梁賢威*，鄒彩霞

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001；2.農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西 南寧 530001)

德昌水牛是中國地方水牛優(yōu)良品種之一，屬于沼澤型水牛，其體格較大，體質(zhì)結(jié)實，生長發(fā)育快，適應(yīng)性廣，役力強，主要分布于海拔為480～2 520 m的四川省涼山彝族自治州安寧河流域的德昌、西昌、冕寧、會理等縣和渡口市的米易縣[1]。深入研究德昌水牛的消化生理以及營養(yǎng)特性有助于地方水牛品種的保護以及開發(fā)利用。

瘤胃是反芻動物獨特的消化器官，其中棲息有數(shù)以億計的微生物，包括細菌、產(chǎn)甲烷古菌、原蟲和真菌等。這些微生物之間的互作對于飼料的消化利用具有重要作用，可以脂肪酸和微生物蛋白的形式為宿主提供能量。近年來，對于產(chǎn)甲烷古菌的研究已成為研究者們關(guān)注的重點。飼料被消化過程中所產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，如氫、甲酸、乙酸、甲醇等，可通過產(chǎn)甲烷菌還原二氧化碳進而生成甲烷[2]。反芻動物的甲烷排放意味著能量的損失以及溫室氣體的增加[3]。目前，已有研究[4–5]表明，多種動物體內(nèi)均可分離出產(chǎn)甲烷菌。部分研究也利用非培養(yǎng)方式，如16S rRNA 基因克隆文庫分析、real–time PCR 等方法研究瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的多樣性及數(shù)量[6–8]。不同肥胖程度的人類或者不同品種的豬腸道中的產(chǎn)甲烷菌結(jié)構(gòu)也存在差異[9–10]。這些研究表明，胃腸道中產(chǎn)甲烷菌的結(jié)構(gòu)組成可能與物種的特異性或與特定功能緊密相關(guān)[11]。作為四川特色遺傳資源品種之一，德昌水牛瘤胃微生物可能具有其獨特的微生物區(qū)系，但目前關(guān)于德昌水牛瘤胃微生物的組成，尤其是產(chǎn)甲烷菌多樣性方面的研究仍處于空白。筆者利用16S rRNA 基因克隆文庫技術(shù)分析德昌水牛瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的結(jié)構(gòu)組成及多樣性，旨在為進一步探索德昌水牛瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)功能以及品種資源保護提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試水牛及飼料

選用3 頭體況基本一致的5 歲左右的健康成年雌性德昌水牛，飼養(yǎng)于廣西壯族自治區(qū)水牛研究所水牛場(國家級重點種畜場)。供試水牛每天08:00和16:00 定時飼喂，自由飲水。自由采食粗料。補充適量精料(每天每頭5.0 kg)。

粗料由玉米青貯料、木薯渣、啤酒渣、新鮮象草組成。精料配方：玉米53.5 %、豆粕6.0%、麥麩15.0%、棉粕17.0%、磷酸氫鈣1.5%、貝殼粉1.0%、食鹽2.0%、小蘇打3.0%、預混料1.0%。精料營養(yǎng)水平：NE 6.83 MJ/Kg，CP 16.75/%，Ca 0.80/%，P 0.94/%，CF 4.54/%。預混料組成：V–E 3 000 IU/kg，V–D 150 kIU/kg，V–A 500 kIU/kg，Cu 1.3 g/kg，F(xiàn)e 4.0 g/kg，Mn 3.0 g/kg，I 80 mg/kg，Zn 6.0 g/kg，Co 80 mg/kg，Se 50 mg/kg。

1.2 方 法

試驗期30 d，第30 天晨飼前通過胃管式瘤胃液采樣器采集瘤胃內(nèi)容物250 mL，裝入干凈充滿二氧化碳厭氧瓶中，置于碎冰塊中冷藏，迅速帶回實驗室，保存于–80 ℃冰箱，備用。

1.3 總DNA 的提取

用寬口吸頭從充分混勻的瘤胃內(nèi)容物樣品(約250 mL)中吸取1.5 mL(包括固液兩相)，12 000 g 離心5 min，去除上清液，收集沉淀，依據(jù)文獻[12]所描述的機械破壁及試劑盒提取相結(jié)合的方法從沉淀樣品中提取總DNA。

1.4 PCR 擴增及16S rRNA 克隆文庫構(gòu)建

利用產(chǎn)甲烷菌特異性引物Met86F/Met1340R[6]擴增16S rRNA 基因序列。引物序列如下： Met86F，5′–GCTCAGTAACACGTGG–3′；Met1340R，5′–CG GTGTGTGCAAGGAG–3′。PCR 反應(yīng)體系如下：10×Buffer 5μL；dNTP(10 mmoL/L) 1 μL；MgCL2(25 mmoL/L) 4 μL；TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.8 μL；l μL總DNA(l～10 ng/mL)，Met86F 和Met1340R 引物(10 μmoL/L)各l μL；加無菌雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(美國Promega)純化PCR 產(chǎn)物。將來自3 頭牛的等體積PCR 產(chǎn)物混合后，按照廠家說明書連接到載體pMD19–T(日本Takara)上進行克隆，經(jīng)藍白斑篩選，隨機挑取白色克隆，用pMD19–T 通用引物M13–47 (5′–CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC–3′)和RV –M(5′–GAGCGGATAACAATTTCACACAGG–3′)對陽性克隆進行驗證，將PCR 檢測為陽性的克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 16S rRNA 基因序列分析

對測序獲得的序列用Decipher軟件去除嵌合體序列[13]。使用Ribosomal Database Project (RDP) Release 11 中的Classifier 程序?qū)λ行蛄羞M行分類[14]。用Mothur 軟件劃分分類操作單元(OTU)，將相似性大于97%的序列視為同一個OTU[15]。選取每個OTU代表序列，利用Blast 程序在Genbank 中搜索相似性最高序列。用Clustal X Version 1.83 軟件進行多重比對，通過MEGA 4.0(Molecular evolutionary genetics analysis，MEGA)軟件計算出序列的系統(tǒng)進化距離，采用Neighbor–Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，1 000 次隨機抽樣，計算自舉值(Bootstrap)以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。本研究所獲得的序列在DDBJ數(shù)據(jù)庫里的登錄號為AB905615～ AB905718。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA 基因克隆文庫分析

從建立的德昌水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌16S rRNA 基因克隆文庫中，隨機挑選107 個陽性克隆進行測序。對測得的序列進行處理，剔除嵌合序列后獲得99個序列，RDP 分析結(jié)果表明，99 個序列均屬于古細菌域(Archaea)序列，其中93 個序列(占總序列數(shù)的94.2%)歸屬Methanobrevibacter 的16S rRNA 序列、5 個(占總序列數(shù)的4.8%)歸屬Methanosphaera (甲烷球菌屬)的16s rRNA 序列、還有1 個(占總序列數(shù)的1.0%)歸屬unclassified_ Methanobacteriaceae (未分類甲烷桿菌)的16S rRNA 序列。以97%序列相似性為閾值，用Mothur 軟件對序列進行分析，99條序列可分為19 個OTUs(表1)。

表1 德昌水牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA 基因序列分析Table 1 Sequence analysis of archaeal 16S rRNA gene from the rumen of Dechang buffaloes

將99 條序列與Genbank 中收錄的序列進行Blast 分析，結(jié)果表明，99 個序列中，有96 個序列(17 個OTUs)占總序列的97.0%，與已知細菌16S rRNA 序列相似性≥97%；其中，3 個OTUs(約占總序列的57.6%)與Methanobrevibacter gottschalkii 的16S rRNA 相似；10 個OTUs(約占總序列的32.3%)與Methanobrevibacter millerae 的16S rRNA 相似；2 個OTUs(約占總序列的4.0%)與Methanosphaera stadtmanae 的16S rRNA 相似；1 個OTUs(約占總序列的1.0%)與Methanobrevibacter ruminantium 的16S rRNA 相似；1 個OTUs(約占總序列的1.0%)與Methanobrevibacter boviskoreani 的16S rRNA 相似；1 個OTUs(約占總序列的1.0%)與Methanobrevibacter smithii 的16S rRNA 相似。另外3 個序列(2 個OTUs)與已培養(yǎng)菌的16S rRNA 序列的相似性為90%～97%，其中1 個OTUs(約占總序列的2.0%)與Methanosphaera stadtmanae 的16S rRNA 相似；1 個OTUs(約占總序列的1.0%)與Methanobrevibacter olleyae 的16S rRNA 相似。

2.2 16S rRNA 基因系統(tǒng)進化分析

以Thermosphaera aggregans(X99556)和Pyrolobus fumartus (X99555)作為外群(Outgroup)，將19 個OTUs 代表序列與其他最相似已知序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖1)表明，D51、D66 與Methanosphaera stadtmanae 聚集為一簇，屬于Methanosphaera；D11、D64、D24、D4、19、D62、32、D6、6、30 與Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter millerae 聚集為一簇(SGMT 簇)，屬于Methanobrevibacter；D49 與Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevi- bacter olleyae 聚集為一簇(RO 簇)，但與Methano- brevibacter 中其他序列相隔較遠；SGMT 簇序列和 RO 簇序列所占總序列的比例分別為75.8%、1.0%；D17、D16、3、35、7、D59 單獨聚集為一簇，與任何已知相近序列都相隔較遠，它們可能代表Methanobrevibacter 中新的種。

圖1 德昌水牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of methanogens 16S rRNA gene sequences from the rumen of Dechang water buffaloes

3 討 論

在瘤胃厭氧條件下，多種厭氧微生物通過共同作用完成有機物的降解。被動物消化的飼料成分，包括植物性結(jié)構(gòu)碳水化合物、蛋白質(zhì)和其他有機聚合物，通過初次厭氧發(fā)酵后都被降解成簡單的物質(zhì)。這些簡單的化合物通過具有水解復雜化合物功能的微生物(初次發(fā)酵微生物)和其他不具有水解復雜化合物功能的微生物(次級發(fā)酵微生物)的共同作用，被進一步轉(zhuǎn)變成脂肪酸、二氧化碳和氫氣等。在瘤胃內(nèi)利用二氧化碳作為碳源，氫作為主要的電子供體的氫利用途徑是主要的產(chǎn)甲烷途徑[16]。甲烷的生成可避免氫分壓升高，以免抑制電子傳遞反應(yīng)中的微生物酶的正常功能，尤其是NADH 脫氫酶，它若被抑制可導致NADH 的積累，最終降低瘤胃發(fā)酵效率。深入了解水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌的結(jié)構(gòu)組成及其多樣性，有助于調(diào)控水牛瘤胃甲烷生成，減少甲烷排放量。產(chǎn)甲烷菌屬于古菌，基于已有的數(shù)據(jù)分析，許多被檢測到的瘤胃古菌都屬于產(chǎn)甲烷微生物，其中主要是Methanobrevibacter，占瘤胃古菌近2/3(61.6%)。剩余的1/3 的古細菌的系統(tǒng)發(fā)育型大致均等，屬于Methanomicrobium 的占14.9%，被標記為不可培養(yǎng)的瘤胃C 簇或RCC 的占15.8%[17]。目前，已有許多關(guān)于反芻動物，如綿羊[18–19]、黃牛[7,20]以及水牛[21–23]的瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)組成的報道，其中水牛以印度水牛為主。關(guān)于中國地方品種水牛瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)組成，尤其是在產(chǎn)甲烷菌多樣性方面的研究仍十分薄弱。據(jù)筆者所知，本研究是國內(nèi)外第一個報道中國地方品種德昌水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性的。

瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)組成受地理位置、周邊環(huán)境、飼料營養(yǎng)水平以及飼喂頻率、添加劑、動物種類以及動物遺傳背景等的影響。一般認為，瘤胃中主要的甲烷菌為瘤胃甲烷短桿菌(Methanobrevibacter ruminantium)和巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkerii)。本研究通過16S rRNA 基因克隆文庫分析，表明德昌水牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌以Methanobrevi- bacter 為主，這與國內(nèi)外(委內(nèi)瑞拉、澳大利亞、中國)許多在其他反芻動物(綿羊、袋鼠、牦牛)上的研究結(jié)果相一致[14,18,24–26]。但是，Chaudhary 等[21]的研究表明，印度摩拉水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌以Methano- microbium 為主；Singh 等[27]的研究表明，蘇替水牛(Surti)瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌以Methanobacteriales 為主；Hook 等[28]的研究表明，在澳大利亞綿羊瘤胃內(nèi)則以未知古菌為主；Shin 等[29]以及Tajima 等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，奶牛瘤胃古菌以Methanomicrobium 為主(分別為85.6%和60.9%)，但Methanobrevibacter 數(shù)量很少。也有研究[31]表明，奶牛體內(nèi)存在大量的Methanosphaera(26.8%)和Methanimicrococcus(14.6%)，但是Methanobrevibacter 占優(yōu)勢(58.5%)。說明不同動物種類之間的瘤胃產(chǎn)甲烷菌結(jié)構(gòu)組成也存在差異。這些異同與研究方法、動物種類、日糧、動物管理等之間的相互關(guān)系還需要進一步研究。

反芻動物瘤胃內(nèi)仍存在許多未知的還未培養(yǎng)出來的產(chǎn)甲烷菌[32]。本研究的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果也表明，德昌水牛瘤胃內(nèi)存在許多未知的Methano- brevibacter 產(chǎn)甲烷菌。Paul 等[33]的研究表明，Methanobrevibacter 能夠利用二氧化碳和氫或者甲酸生成甲烷；Rea 等[34]從黃牛瘤胃中分離到的Methanobrevibacter millerae 能夠利用甲酸生長；Samuel 等[35]發(fā)現(xiàn)Methanobrevibacter smithii PS 可利用二氧化碳和氫或者甲酸生成甲烷；Denman 等[7]的研究表明，反芻動物體內(nèi)的Methanobrevibacter smithii 能夠影響日糧中的多糖成分的利用效率。以上研究表明，Methanobrevibacter 產(chǎn)甲烷菌對于反芻動物瘤胃甲烷生成以及其他生理功能具有重要作用。關(guān)于Methanobrevibacter 產(chǎn)甲烷菌在德昌水牛瘤胃生理功能的作用還有待進一步研究。

St–pierre 等[36]提議將Methanobrevibacter 中的產(chǎn)甲烷菌序列分為兩大類：與Methanobrevibacter smithii(S) 、 Methanobrevibacter gottschalkii(G) 、Methanobrevibacter millerae (M)和Methanobrevibacter thaurei(T)聚集在一塊的統(tǒng)稱為SGMT 簇；與M. ruminantium (R) 及Methanobrevibacter olleyae (O)聚集在一起的稱為RO 簇。不同種類動物或不同條件下的動物胃腸道的SGMT 和RO 簇序列分布規(guī)律可能存在一定差異。在同等日糧條件下，荷斯坦奶牛瘤胃中的SGMT 簇序列的比例要高于娟姍奶牛[20]。在本研究中SGMT 簇序列和RO 簇序列所占總序列的比例分別為75.8%、1.0%，即在德昌水牛瘤胃中SGMT 簇序列占大多數(shù)。不同動物種類及飼養(yǎng)條件造成的SGMT 簇和RO 簇序列分布的差異，是否可以用于估測瘤胃甲烷生成，進而用于調(diào)節(jié)瘤胃甲烷生成，還有待深入研究。

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