清補(bǔ)通絡(luò)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

邱遠(yuǎn)金，朱國強(qiáng) ，高 輝 ，楊成新，賈曉光

（1．新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002； 2．新疆維吾爾自治區(qū)第六人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830013）

清補(bǔ)通絡(luò)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

邱遠(yuǎn)金1，朱國強(qiáng)1，高 輝2，楊成新2，賈曉光1

（1．新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002； 2．新疆維吾爾自治區(qū)第六人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830013）

目的 建立清補(bǔ)通絡(luò)丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜（TLC）法鑒別清補(bǔ)通絡(luò)丸中的丹參、枳殼、延胡索、赤芍，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定該藥中丹酚酸B的含量。結(jié)果 丹參、枳殼、延胡索、赤芍的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離較好，對應(yīng)的空白和輔料均無干擾；HPLC法測定結(jié)果顯示，丹酚酸B進(jìn)樣量在0．28～2．52 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r＝0．999 9），平均回收率為97．74%，RSD為1．21%（n＝6）。結(jié)論 該方法重復(fù)性好、結(jié)果可靠，可為清補(bǔ)通絡(luò)丸質(zhì)量控制方法的建立提供參考。

清補(bǔ)通絡(luò)丸；薄層色譜；高效液相色譜；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

清補(bǔ)通絡(luò)丸（批準(zhǔn)文號為新藥制字Z20120001）是由新疆維吾爾自治區(qū)第六人民醫(yī)院感染科中醫(yī)師經(jīng)多年經(jīng)驗(yàn)及臨床實(shí)踐總結(jié)，由丹參、枳殼、延胡索、赤芍等15味中藥組方的純中藥制劑，主要用于治療急、慢性布魯桿菌病。本研究中建立了測定該制劑中丹酚酸B含量的高效液相色譜（HPLC）法，并采用薄層色譜（TLC）法對方中君藥丹參，臣藥枳殼、延胡索和赤芍進(jìn)行了定性鑒別研究，旨在為建立清補(bǔ)通絡(luò)丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

SK5200型 HP超聲儀（59 Hz，200 W）；Metter EL104型電子分析天平；LC20－10A型高效液相色譜儀（島津）。硅膠G板（10cm×20 cm，硅膠G為青島海洋化工廠產(chǎn)品）；蒸餾水、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、乙醇、石油醚（60～90℃），乙醚、甲醇、甲酸乙酯、香草醛、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）等。芍藥苷對照品（批號為110736－200731），延胡索乙素對照品（批號為 110726－200610），丹參對照藥材（批號為 120923－200911），延胡索對照藥材（批號為120928－200604），由中國藥品生物制品檢定所提供；丹參酮ⅡA對照品（批號為201011），丹酚酸B對照品（批號為201002），新橙皮苷對照品（批號為201004），柚皮苷對照品（批號為201008），由四川維克奇生物科技有限公司提供。清補(bǔ)通絡(luò)丸（規(guī)格為 0．2 g ／丸，批號為 20100615，20100616，20100617），丹參陰性、延胡索陰性、枳殼陰性和赤芍陰性樣品均由新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 定性鑒別

枳殼：取本品10 g，研碎，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用乙醚洗滌2次，每次30 mL，棄去乙醚液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，棄去水液，正丁醇液減壓濃縮至干，用2 mL甲醇溶解，加在中性氧化鋁柱上（100～120目，5 g，內(nèi)徑10～15 mm），用120 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取柚皮苷和新橙皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。再取缺枳殼的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗(yàn)[1]，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液2～3 μL、對照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶6∶2）下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱約5 min，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)，說明陰性對照無干擾（見圖1A）。

丹參：取本品20 g，加硅藻土10 g，研磨均勻，加乙醚80 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液揮干，加乙酸乙酯0．5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g，加乙醚20 mL，超聲20 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺丹參藥材的陰性樣品20 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗(yàn)[1]，吸取供試品溶液及陰性對照品溶液各15 μL、對照藥材和對照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)，說明陰性對照無干擾（見圖1B）。

延胡索：取本品10 g，加硅藻土5 g，研磨均勻，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加濃氨試液調(diào)至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索對照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加濃氨試液調(diào)至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺延胡索藥材的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗(yàn)[1]，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以0．1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯－丙酮（9∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中約3 min后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)，說明陰性對照無干擾（見圖1C）。

赤芍：取芍藥苷對照品，加甲醇分別制成每1 mL含1．0 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺赤芍藥材的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗(yàn)[1]，吸取枳殼鑒別項(xiàng)下供試品溶液及陰性對照品溶液、對照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇－甲酸（40∶5∶10∶0．2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱使斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜中則無互斑點(diǎn)，說明陰性對照無干擾（見圖1D）。

圖1 薄層色譜圖

2．2 丹酚酸B含量測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇－乙腈 －甲酸 －水（30∶10∶1∶59）；檢測波長：286nm；流速：1mL／min；柱溫：30℃。

2．2．2 溶液制備

稱取丹酚酸B對照品0．007 1 g，置50 mL容量瓶中，加75%甲醇溶解，定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0．140 2 mg／mL的對照品溶液。取清補(bǔ)通絡(luò)丸適量，研碎，精密稱取粉末4 g，加甲醇50 mL，精密稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，冷卻，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，濾液作為供試品溶液。取除丹參外的處方中其余藥標(biāo)按清補(bǔ)通絡(luò)丸處方與制法制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及陰性干擾試驗(yàn)：分別取對照品溶液、供試品溶液、缺丹參的陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照品溶液圖譜中，在丹酚酸B的出峰位置無干擾峰，表明在本試驗(yàn)條件下丹酚酸B峰與其他組分峰分離完全，理論板數(shù)按丹酚酸B計(jì)算不低于2 000。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液 2，4，6，8，10，12，14，16，18 μL，分別注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定面積。以峰面積為縱坐標(biāo)、丹酚酸B質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝1×106X－35 188，r＝0．999 9（n＝9）。結(jié)果表明，丹酚酸B檢測質(zhì)量在0．280 4～2．523 6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按擬訂的色譜條件測定峰面積。結(jié)果峰面積的平均積分值為 1 338 083，RSD＝0．74%（n＝5），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，16，24 h時(shí)按擬訂色譜條件測定丹酚酸B峰面積。結(jié)果峰面積平均值為 21 315 66，RSD＝1．39%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取同批次供試品6份，依法制備供試品溶液并測定丹酚酸 B含量。結(jié)果平均含量為2．642 7 mg／g，RSD＝1．97%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量（2．651 0 mg／g）供試品6 份，分別精密加入對照品溶液 0．5 mL（0．140 2 mg／mL），按供試品溶液制備方法制備溶液，各取10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定丹酚酸B含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2．2．4 樣品含量測定

取3批供試品，按擬訂色譜條件和方法測定丹酚酸B的含量。結(jié)果批號為20100515，20100516，20100517的3批供試品中丹酚酸B 含量分別為 2．743 8，2．709 2，2．516 4 mg／g，平均 2．656 5 mg／g。因此，暫訂清補(bǔ)通絡(luò)丸中含丹參以丹酚酸B計(jì)不得低于2mg／g。

表1 丹酚酸B加樣加收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3 討論

本試驗(yàn)中采用多指標(biāo)鑒別和含量測定手法，有利于控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效。在枳殼和赤芍的薄層色譜鑒別中，主要在2010年版《中國藥典（一部）》[1]的基礎(chǔ)上對供試品溶液制備條件進(jìn)行了優(yōu)化。供試品經(jīng)甲醇提取后蒸干、溶解、過中性氧化鋁柱、甲醇洗脫，蒸干收集的洗脫液，溶解得供試品溶液；由圖1A和圖1D可知，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，且陰性無干擾。丹參和延胡索定性鑒別主要參照2010年版《中國藥典（一部）》[2]方法進(jìn)行薄層色譜鑒別試驗(yàn)，由圖1B和圖1C可知，在供試品溶液圖譜中，與對照品和對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對照品溶液色譜在相應(yīng)位置上則無此斑點(diǎn)，說明陰性無干擾。

丹參作為方中君藥之一，作用至關(guān)重要，故將丹酚酸B作為含量測定的指標(biāo)性成分。參考2010年版《中國藥典（一部）》丹參項(xiàng)下丹酚酸B含量測定方法，對3批供試品中丹酚酸B含量進(jìn)行了測定，根據(jù)測定結(jié)果，暫訂清補(bǔ)通絡(luò)丸中丹酚酸B含量不得少于2 mg／g。因此，文中所建立的方法測定結(jié)果較穩(wěn)定，分離效果較好，可用于制劑的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅥB，70－71，130－131，147 －148，229－230．

作者簡介：邱遠(yuǎn)金（1981－），男，漢族，四川內(nèi)江人，助理研究員，主要從事天然事物化學(xué)研究；朱國強(qiáng)，副研究員，主要從事中藥學(xué)研究，本文通訊作者，（電話）0991－2615137（電子信箱）zgqzyc＠163．com。

Study on Quality Standard of Qingbutongluo Pill

Qiu Yuanjin1，Zhu GuoQiang1，Gao Hui2，Yang Chengxin2，Jia Xiaoguang1（1．Research Institute of Chinese Medicine and Ethnic Drugs of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Wulumuqi，Xinjiang，China830002；2．Sixth People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Wulumuqi，Xinjiang，China830013）

Objective To establish the quality standard of Qingbutongluo Pill．Methods Traditional Chinese medicines in prescription such as Salvia miltiorrhiza Bge，Citrus aurantiumL．，Corydalis yanhusuo W．T．Wang and Paeonia lactiflora Pall were identified by the TLC method．The content of salvianolic acid B in Qingbutongluo Pill was determined by the HPLC method．Results The spots in the TLC were clear and could be well separated，the corresponding blank and adjuvants had no interference；the HPLC method showed that the linear range of salvianolic acid B was 0．28 ～2．52 μg（r＝0．999 9）；the average recovery rate was 97．74% ，RSD1．21% （n＝6）．Conclusion This method is good in repeatability and reliable in the detection results，and can provide reference for establishing the quality control method of Qingbutongluo Pill．

Qingbutongluo Pill；TLC；HPLC；quality standard

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2014）02－0048－03

2012－09－24；修回日期：2013－07－11）