漢麻果膠皂苷類成分分離及其抗真菌活性研究

袁 野，蔡光明

（1．四川文理學(xué)院，四川 達(dá)州 635000； 2．中國人民解放軍第302醫(yī)院·全軍中藥研究所，北京 100039）

漢麻Cannabis sativaL Hemp是一年生大麻科植物，又名大麻、寒麻、線麻、火麻、魁麻等，是我國原產(chǎn)作物之一，主要分為纖維用漢麻、藥用漢麻和籽用漢麻3種[1]。漢麻全身是寶，其韌皮用于紡織；桿芯用于研磨生產(chǎn)木粉、制造活性炭和造紙；麻葉、麻花、麻根提取的藥物，有止血、散瘀、解毒、安胎等功效；麻籽可提取出相當(dāng)于深海魚油含量的不飽和脂肪酸；油渣可制取生物柴油[2－3]。漢麻織物有一定的抑制細(xì)菌生長作用，通過對漢麻纖維天然抗菌特性的測試分析，發(fā)現(xiàn)漢麻纖維對造成人體腳氣病和股癬的須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌3種真菌具有顯著的抑制效果[4－5]。在漢麻加工過程中，麻農(nóng)在漢麻浸泡脫膠處理的水溶液中操作時(shí)發(fā)現(xiàn)，原患有的腳氣病不治而愈，且療效極佳。本課題前期通過系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)法確定了漢麻果膠中含有生物堿、黃酮、皂苷、多糖、甾體、萜類、鞣質(zhì)或酚類、蒽醌類和揮發(fā)油等成分[6]，并測定總皂苷的平均含量約為0．36%[7]。本研究中以蕨麻苷Ⅱ?yàn)閷φ掌?，采用D101大孔樹脂對漢麻果膠皂苷成分進(jìn)行初步分離，并采用微量液基稀釋法研究皂苷各洗脫部位對常見致病真菌的體外抗真菌活性，為進(jìn)一步研究漢麻果膠抗真菌有效部位提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器、材料與試驗(yàn)菌株

電熱數(shù)字顯示恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；SHZ－95型循環(huán)水式多用真空泵（河南省鞏義市英峪儀器廠）；R501B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；AL204型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；回流提取裝置（100mL圓底燒瓶、球形冷凝管）。

漢麻果膠干燥粉末（取自鮮莖皮桿分離和干莖皮桿分離時(shí)脫下的粉狀物質(zhì)，由總后勤部軍用漢麻材料研究中心提供，取材于西雙版納漢麻種植基地）；薄層層析用硅膠G板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、冰醋酸、醋酐、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇均為分析純；D101型大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）；蕨麻苷Ⅱ（2α，3β，19β－三羥基 －烏蘇酸 －28－O－β－D－吡喃半乳糖苷，由解放軍第302醫(yī)院中藥研究所制備并鑒定，經(jīng)高效液相色譜歸一化法計(jì)算，純度大于98%）；蘆丁和槲皮素（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 100080－200306，100081－200406）；馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、燕麥培養(yǎng)基、沙氏液基（SDA）（均由北京科昊澤生物技術(shù)有限公司提供）。

紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum，編號01657）、須癬毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes，編號 31016）、犬小孢子菌（Microsporum canis，編號 7060）、白色念珠菌（Candida albicans，編號 05556），均由北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心包藏菌株。

2 方法與結(jié)果

2．1 方法

2．1．1 成分提取和分離

取漢麻果膠原料粉末10 g，加入80%乙醇浸泡24 h，置回流加熱裝置上回流提取3次，加入溶劑量分別為8倍量、5倍量、4倍量，提取時(shí)間為每次1．5 h，合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（－0．1 kPa，65～70℃）回收溶劑，至無乙醇味。加入乙醇至含醇濃度為30%（相當(dāng)于每1 mL中含有0．4 g原生藥），靜置24 h，過濾，取上清液。上清液經(jīng)D－101型大孔吸附樹脂柱，分別用水及10%，30%，50%，70%，80%，95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，回收各洗脫部分濃縮至干，分別進(jìn)行泡沫試驗(yàn)和Liebermann－Burchard反應(yīng)[8]，以反應(yīng)是否呈陽性確定皂苷類成分洗脫部位。

取適量皂苷洗脫粉末，溶于5 mL甲醇中，依2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，各吸取2 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開條件分別為：以蕨麻苷Ⅱ?yàn)閷φ掌?，以氯仿－丙?－甲醇 －甲酸（7∶1∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；以蘆丁和槲皮素為對照品，以氯仿－甲醇－水（65∶35∶20，下層）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%AlCl3乙醇溶液，晾干，置紫外燈下觀察。篩選出出現(xiàn)與對照品相應(yīng)斑點(diǎn)的洗脫部分，作為供試品。

2．1．2 供試品溶液制備

稱取洗脫物各6．4 mg，溶于2 mL二甲基亞砜（DMSO）中，配制成質(zhì)量濃度為3 200 μg／mL的溶液，經(jīng)0．22 μm的過濾器除菌后，保存在4℃冰箱備用。用RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋50倍后，再進(jìn)行倍比稀釋成2倍終濃度，質(zhì)量濃度由高到低依次為64，32，16，8，4，2，1，0．5，0．25，0．125，0．06 μg ／mL。分別將各質(zhì)量濃度的藥物加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。1～10列為藥物各濃度，11列為生長對照，12列為空白對照以及溶劑對照。

2．1．3 菌懸液制備

皮膚癬菌經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化，紅色毛癬菌經(jīng)燕麥培養(yǎng)基活化，取菌溶于2 mL 0．9%氯化鈉注射液中，待沉降后，取上清液比濁儀計(jì)數(shù)為 0．5麥?zhǔn)蠞岫龋ㄏ喈?dāng)于 1×105～5×105CFU ／mL），用RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋100倍，得最終菌懸液濃度為1×103～5×103CFU／mL；白色念珠菌經(jīng)SDA培養(yǎng)基活化后，取上清液比濁儀計(jì)數(shù)為 0．5麥?zhǔn)蠞岫龋?×106～5×106CFU ／mL），用 RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋2 000倍，得最終菌懸液濃度為 0．5×103～2．5 ×103CFU ／mL。

2．1．4 接種

設(shè)置溶劑對照組和空白對照組。分別將各菌懸液100 μL接種于配制好的藥敏板中，35℃溫箱培養(yǎng)。

2．1．5 結(jié)果判定

皮膚癬菌4～6 d觀察結(jié)果，白色念珠菌24～48 h觀察結(jié)果。在不攪動(dòng)情況下肉眼判斷，溶液清晰透明視為真菌完全不生長，取完全不生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

2．2 結(jié)果與分析

2．2．1 成分分離試驗(yàn)

結(jié)果見表1和圖1。由表1可知，乙醇濃度為50%以上的各洗脫部分對皂苷類專屬試驗(yàn)均呈陽性，說明50%以上濃度的乙醇可將皂苷成分洗脫下來。而30%以下的洗脫液呈陰性，這可能由于其中所含皂苷成分較少，可溶性雜質(zhì)含量較多，因此在試驗(yàn)中，可作為除雜溶液。

表1 各洗脫部分定性結(jié)果

圖1 70%和80%洗脫部分薄層色譜法檢識圖

由圖1可見，漢麻果膠提取物在經(jīng)D101大孔樹脂分離純化后，雖然70%和80%的洗脫液對皂苷類試驗(yàn)均呈陽性，但所含的皂苷類成分存在一定的差異，其中80%洗脫液在展開條件下，在相應(yīng)位置出現(xiàn)與對照品溶液相同的藍(lán)色斑點(diǎn)，這說明該洗脫部位含有與對照品結(jié)構(gòu)相同或相類似的成分，但70%洗脫液盡管增加點(diǎn)樣量，并未出現(xiàn)類似斑點(diǎn)。70%洗脫液經(jīng)展開劑展開后置紫外燈下觀察，呈現(xiàn)較多的黃色熒光斑點(diǎn)，并出現(xiàn)與兩對照品溶液相近比移值斑點(diǎn)，而前期試驗(yàn)測定顯示70%乙醇洗脫液中黃酮類成分的含量大約為50%，說明該部位含有較多的黃酮類成分，高于皂苷類成分的含量；相反，80%洗脫液未出現(xiàn)明顯的熒光斑點(diǎn)，表明其中含有較少的黃酮類成分，這與已有的試驗(yàn)結(jié)果一致[9]，同時(shí)含量測定試驗(yàn)也顯示，該洗脫部位的皂苷類成分高于黃酮類成分的含量[10]。

2．2．2 抗真菌試驗(yàn)

漢麻果膠洗脫物的MIC結(jié)果見表2。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)起草的M－27P方案規(guī)定，MIC不大于32 μg／mL時(shí)，認(rèn)為其對真菌具有敏感性。由表2可見，80%洗脫物對須毛癬菌、紅色念珠菌、犬小孢子菌均有較好的抑制作用，其MIC分別為16，8，2 μg／mL，其中對犬小孢子菌的抑菌效果最好，這可能與其中含有的大量的皂苷類成分有關(guān)；70%洗脫物僅對犬小孢子菌具有一定的抑制作用，其MIC為16 μg／mL，但由于該洗脫部分中含有大量的黃酮類成分，因此無法確定其是否為皂苷類成分起作用。兩洗脫部分對白色念珠菌均未表現(xiàn)出明顯的抑菌作用。從以上分析結(jié)果可知，70%和80%乙醇洗脫物具有不同的生物活性，抗真菌有效部位為后者。

表2 漢麻果膠70%和80%洗脫物的 MIC（μg／mL，n＝3）

3 討論

真菌病是一種感染性皮膚病，發(fā)病率高，病原菌種類繁多，臨床上根據(jù)致病菌種類不同，可分為淺部真菌感染和深部真菌感染。目前臨床上常用的抗真菌藥物可分為多烯類、唑類、棘白霉素類等，然而致病真菌對抗真菌藥物耐藥性問題日趨凸顯，給臨床治療帶來很大的困難。中藥抗真菌劑具有來源廣泛、毒副作用小、廣譜、藥效長等優(yōu)點(diǎn)，可在真菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多方面的藥理效應(yīng)，很少出現(xiàn)耐藥，適合于長期及預(yù)防性應(yīng)用。體外試驗(yàn)表明，從天然產(chǎn)物中分離提取的黃酮類、醌類、酰胺類、羧酸類、生物堿、萜類、甾體類、酚類和醛類等成分具有一定的抗真菌作用。在對漢麻果膠進(jìn)行全化學(xué)成分分析之后，為確定漢麻果膠抗真菌有效部位和有效成分，本課題組首先研究皂苷類成分。由于尚未見有關(guān)漢麻果膠對照品的相關(guān)報(bào)道，因此在研究皂苷類成分時(shí)需要尋找合適的對照品，經(jīng)過反復(fù)薄層色譜分析發(fā)現(xiàn)，80%乙醇洗脫物經(jīng)氯仿－甲醇（85∶15）展開劑展開后，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱顯色后，在相應(yīng)位置出現(xiàn)與本試驗(yàn)室制備的蕨麻苷Ⅱ相同的藍(lán)色斑點(diǎn)，因此在研究漢麻果膠皂苷成分時(shí)選取蕨麻苷Ⅱ作為對照品。

在利用大孔樹脂分離純化漢麻果膠提取物時(shí)，以蕨麻苷Ⅱ作為對照品對各洗脫部分進(jìn)行薄層色譜檢識，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%濃度的乙醇始終無法將該類成分洗脫下來，而當(dāng)洗脫濃度增加至80%時(shí)，洗脫液中才出現(xiàn)該斑點(diǎn)，且從這兩部分洗脫液薄層色譜分析結(jié)果來看，兩者所含皂苷類成分存在明顯的不同，同時(shí)結(jié)合已有的含量測定結(jié)果，上柱時(shí)分別采用水、30%乙醇進(jìn)行除雜，再分別用濃度70%和80%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集得到的80%濃度的洗脫液中皂苷類成分和黃酮類成分可實(shí)現(xiàn)初步分離。另一項(xiàng)體外研究表明[10]，70%乙醇洗脫物具有廣譜的抗細(xì)菌作用，因此該洗脫工藝也能達(dá)到將具有不同生物活性的有效部位進(jìn)行分離的目的。

目前本課題組綜合各種化學(xué)手段已從70%乙醇洗脫物中分離得到是nemerosin、香草醛、濱蒿內(nèi)酯、蘆丁等7種化合物[11]，在今后的工作中，本課題組將采用硅膠柱色譜、薄層色譜制備等方法對抗真菌部位進(jìn)行分離鑒定，篩選出抗真菌有效成分，從而為研發(fā)出一種能夠有效治療皮膚淺部真菌感染的中藥新藥外用制劑提供科學(xué)依據(jù)。

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