氨基酸柱前衍生化法在動物藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用*

李 婷，劉 力，徐德生

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

中藥在我國已經(jīng)有著幾千年的悠久歷史，在應(yīng)用過程中形成了獨特的理論體系和應(yīng)用形式，見證了我國歷史文化的繁榮發(fā)展以及自然資源的豐富多彩，對于中華民族的繁衍生息作出了重大貢獻(xiàn)[1]。動物藥作為中藥的重要組成部分之一，在疾病預(yù)防、治療等方面發(fā)揮著重要的作用。近幾年來，動物藥的應(yīng)用受到越來越廣泛的重視，其活性成分研究也獲得了較大的進(jìn)展。蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等作為動物藥的有效成分，其質(zhì)量控制對于評價動物藥質(zhì)量的優(yōu)劣非常關(guān)鍵。目前應(yīng)用于氨基酸檢測的方法很多，柱前衍生化法具有操作簡單、方便易行、檢測快速準(zhǔn)確的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于動物藥中氨基酸類成分的測定。柱前衍生化法屬于氨基酸間接分析法之一，是使樣品組分在特定的條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)色或發(fā)光的衍生物后，再進(jìn)行色譜的分離和測定。它具有衍生化的條件可以任意選擇，衍生化反應(yīng)的溶劑可與流動相不匹配，衍生化過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物可預(yù)先除去以免干擾檢測等諸多優(yōu)點?，F(xiàn)就目前動物藥中氨基酸類成分檢測的幾種常用柱前衍生化方法研究情況進(jìn)行介紹。

1 樣品制備

1．1 游離氨基酸制備

動物藥中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸類成分，其中只有小部分氨基酸以游離態(tài)存在于藥物中，大多數(shù)氨基酸都以結(jié)合態(tài)存在于蛋白質(zhì)、肽中，因此許多情況下需要水解后再進(jìn)行測定。游離氨基酸一般以游離態(tài)的形式存在于藥材中，較易溶出，選擇適宜的溶劑，采用超聲法或微波法即可提取出來。

1．2 非游離氨基酸制備

對于結(jié)合態(tài)的氨基酸，需要使用化學(xué)物理方法使蛋白質(zhì)、肽類降解后進(jìn)行檢測，且水解法能較全面地反映出樣品中氨基酸的情況，常用的水解方法有以下幾種。

酸水解：是最常用的一種水解方法，其原理是使蛋白質(zhì)等在強(qiáng)酸條件下水解為小分子的肽類或氨基酸。水解液的組成為含0．1% ～1．0% 苯酚的 6 mol／L HCl溶液[2]，通常是將樣品置安瓿瓶中，加入水解液抽真空封口，再置高溫環(huán)境中水解。常用水解溫度和時間有110℃和24 h，130℃和5 h，150℃和1 h，可根據(jù)試驗需要靈活選擇。酸水解法操作簡單、應(yīng)用廣泛，但可引起一些或部分氨基酸的破壞，會對分析結(jié)果造成影響。

堿水解：適宜濃度的堿液可使膠原蛋白發(fā)生降解，釋放小分子物質(zhì)到溶劑中[3]。堿水解法常用溶液為6 mol／L NaOH溶液或4%CaO溶液。堿水解法水解迅速、徹底，對于色氨酸的測定較適用，但會使含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象。

酶水解：酶具有很高的活性和專一性，其水解反應(yīng)可在常溫常壓以及溫和的酸堿條件下進(jìn)行[4]，無環(huán)境污染，水解產(chǎn)品營養(yǎng)價值高，對于動物藥鮮藥材的水解有著很大的優(yōu)勢。酶水解蛋白對氨基酸沒有破壞作用，但一種酶只能使其發(fā)生部分水解[5]，很大程度上限制了其在蛋白質(zhì)水解測定中的應(yīng)用。

微波水解：是指樣品和溶劑共同處在微波場中時，組分分子受到高頻電磁波的作用產(chǎn)生熱效應(yīng)，從提取物中迅速擴(kuò)散到溶劑中，快速完成水解過程的一種方法。與傳統(tǒng)的水解方式相比，微波水解法具有加熱時間短、效率高、簡便易行等優(yōu)點，可極大地提高了樣品中蛋白質(zhì)、肽類成分的水解效率[6]，但需要特別的裝置，樣品水解時間可根據(jù)樣品的性質(zhì)等來確定。

2 衍生化方法的優(yōu)勢

研究表明，大多數(shù)氨基酸無紫外吸收，需要通過衍生化，在一定條件下利用某個特定試劑在色譜柱前與樣品進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，使反應(yīng)產(chǎn)生的衍生物利于色譜的分離或檢測[7]。柱前衍生反應(yīng)條件可以任意選擇，無反應(yīng)動力學(xué)的限制；衍生化副產(chǎn)物對樣品分析產(chǎn)生的干擾可通過預(yù)處理以降低或消除；允許多步反應(yīng)的進(jìn)行；衍生化試劑的選擇較多；儀器設(shè)備要求相對簡單，應(yīng)用廣泛。

3 幾種常用的衍生化方法

3．1 異硫氰酸苯酯衍生化法

原理：異硫氰酸苯酯（PITC）可在室溫下改變氨基酸原有的結(jié)構(gòu)，引入苯環(huán)，生成苯氨基硫甲酞衍生物（PTA－AA），衍生物可進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）檢測[8]。

優(yōu)點：可同時與一級、二級氨基酸發(fā)生反應(yīng)；衍生產(chǎn)物較穩(wěn)定，凍干后可于－20℃冷凍貯存1個月，在水溶液中衍生產(chǎn)物4℃可冷藏貯存72 h，色譜響應(yīng)值無明顯變化；衍生產(chǎn)物單一，副產(chǎn)物少。

缺點：樣品制備過程煩瑣；殘留試劑需采用特定方法預(yù)先除去；衍生試劑對色譜柱有較大傷害等。

應(yīng)用：駱達(dá)等[9]采用PITC法分析龜甲中膠原蛋白，定量分析了其中的羥脯氨酸，并計算得到龜甲中膠原蛋白的量，此法適用于龜甲膠原蛋白的快速分析。吳萍等[10]以PITC為衍生試劑分離并測定羚羊角和羚羊角塞針劑中氨基酸含量，結(jié)果表明羚羊角及其角塞針劑中都富含脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸等16種氨基酸，從兩種針劑中分離出近20個色譜峰，對其中6個較大的峰作質(zhì)譜（MS）分析，從另一個角度驗證了羚羊角及其角塞針劑中含有相似的成分，為羚羊角及其角塞針劑有效成分的測定和開發(fā)提供了實驗依據(jù)。石巖等[11]研究測定了10批鹿角膠樣品中絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸等9種氨基酸，建立了其中L－羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L－脯氨酸4個氨基酸的含量測定方法，為鹿角膠的進(jìn)一步質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

3．2 2，4－二硝基氟苯衍生化法

原理：2，4－二硝基氟苯（DNFB）在弱堿性（pH 8～9）、暗處、室溫或加熱條件下，很容易與氨基酸的α－氨基發(fā)生反應(yīng)，衍生產(chǎn)物呈黃色。

優(yōu)點：可同時與一級、二級氨基酸反應(yīng)；衍生產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定；靈敏度高。

缺點：衍生步驟煩瑣；試劑毒性較大；對色譜柱傷害較大；衍生化副產(chǎn)物會影響分離效果[12]。

應(yīng)用：趙清等[13]以DNFB為衍生劑，建立了測定僵蠶不同炮制品中游離氨基酸和?；撬岷康闹把苌鶫PLC法，表明僵蠶經(jīng)過炮制后體內(nèi)游離氨基酸含量有不同程度的降低；不同的炮制方法對僵蠶各指標(biāo)性成分含量有一定程度的影響，但影響幅度不同。王殿波等[14]采用DNFB法比較了不同生境及地區(qū)的哈蟆油藥材中氨基酸含量，結(jié)果表明同一地區(qū)林下產(chǎn)哈蟆油藥材中氨基酸含量普遍高于稻田產(chǎn)，相同生境中林下產(chǎn)哈蟆油藥材以吉林產(chǎn)地氨基酸含量最高，稻田產(chǎn)哈蟆油藥材以遼寧產(chǎn)地氨基酸含量最高，這對于該藥材的質(zhì)量評價具有一定實際意義。詹云麗等[15]采用該法建立了廣地龍藥材中氨基酸類成分的HPLC指紋圖譜分析方法，考察了15批廣地龍藥材中18種氨基酸的含量，結(jié)果表明其HPLC指紋圖譜有較大的相似性，但含量有所差異，為廣地龍藥材的生產(chǎn)、鑒別和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

3．3 6－氨基哇琳基－N－琥珀酰－亞胺基甲酸酯衍生化法

原理：6－氨基哇琳基－N－琥珀酰－亞胺基甲酸酯（AQC）是近年來廣泛使用的柱前衍生化試劑之一。AQC是一種具有反應(yīng)活性的雜環(huán)氨基甲酸酯，與氨基酸反應(yīng)，迅速生成高穩(wěn)定性的脲[16]。

優(yōu)點：可與一級、二級氨基酸同時反應(yīng)；衍生物性質(zhì)穩(wěn)定；有很強(qiáng)的紫外吸收。

缺點：衍生試劑的水解產(chǎn)物影響分離。

應(yīng)用：楊輝等[17]以AQC為衍生劑，采用HPLC法測定了全蠶粉中氨基酸成分，結(jié)果所測定的3批全蠶粉蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%，含16種氨基酸，含量為20%，其中必需氨基酸約占50%，為家蠶的進(jìn)一步開發(fā)提供了依據(jù)。朱偉偉[18]以AQC為衍生劑，建立了犀牛角中氨基酸類成分的柱前衍生化含量測定方法，并對其中17種氨基酸的含量進(jìn)行比較分析，試驗結(jié)果表明，犀牛角中含有大量的氨基酸，其總氨基酸含量高達(dá)41．3%，這對于犀牛角藥用價值的研究以及尋找新的犀牛角藥用替代物具有積極意義。

3．4 鄰苯二甲醛衍生化法

原理：鄰苯二甲醛（OPA）以巰基乙醇作為還原劑時可與一級氨基酸反應(yīng)，生成異吲哚結(jié)構(gòu)衍生物，具有強(qiáng)熒光。

優(yōu)點：衍生反應(yīng)快速徹底，靈敏度高，成本相對較低，且衍生化試劑過量不會影響樣品的分離。

缺點：不能與二級氨基酸直接反應(yīng)；氨基酸衍生物極不穩(wěn)定，衍生后需立即進(jìn)樣分析；胱氨酸衍生產(chǎn)物產(chǎn)量很低而不能被檢出。

應(yīng)用：李曉蒙等[19]采用OPA柱前衍生反相HPLC法測定了水牛角與羚羊角中氨基酸類成分，發(fā)現(xiàn)這兩種角類藥材中氨基酸的種類基本相同，但含量有較明顯差異，天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸和酪氨酸在羚羊角中含量較高，水牛角含量相對較高的氨基酸則是丙氨酸和纈氨酸，說明柱前衍生化法HPLC可用于這兩種藥材的鑒別研究。趙建國等[20]將僵蠶提取液用鹽酸水解后，采用柱前衍生化HPLC法測定了其中15種氨基酸的種類與含量，結(jié)果表明僵蠶提取液中蛋白質(zhì)和多肽為主要組成部分，為僵蠶抗凝活性作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。李清霞等[21]以O(shè)PA柱前衍生化法對桑蠶蛹中13種氨基酸的組成及含量進(jìn)行了分析，為開發(fā)蠶蛹新資源提供了理論依據(jù)。宋建平等[22]采用柱前衍生化HPLC法分析不同年齡不同部位麋鹿角中18種氨基酸的含量，并與鹿角進(jìn)行比較，結(jié)果表明不同年齡不同部位麋鹿角中氨基酸組成相似，亦與鹿角相似，但含量均有所差異，這為麋鹿角的資源開發(fā)利用、藥材品質(zhì)評價提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

3．5 OPA－FMOC衍生化法

原理：9－氯甲酸芴甲酯（FMOC－Cl）在特定的條件可與氨基酸類成分反應(yīng)生成具有強(qiáng)熒光性質(zhì)的產(chǎn)物（FMOC－AA）。因OPA只能與一級氨基酸反應(yīng)，故實際應(yīng)用中常將兩種試劑合用，先用OPA與一級氨基酸反應(yīng)，再用FMOC－Cl與其余氨基酸反應(yīng)，以對樣品中氨基酸進(jìn)行較全面的檢測。

優(yōu)點：反應(yīng)迅速、完全；化合物穩(wěn)定；方法簡便、快速；可同時測定一級與二級氨基酸。

缺點：FMOC－CL本身及其水解產(chǎn)物（FMOC－OH）都有熒光，會在一定程度上干擾色譜的分離；與一些氨基酸形成的衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，如組氨酸。

應(yīng)用：劉相輝等[23]采用柱前衍生HPLC法進(jìn)行了水蛭提取物中游離氨基酸和水解總氨基酸的含量測定研究，測定了水蛭提取物中的17種氨基酸，為水蛭的質(zhì)量評價提供了依據(jù)。裴福成等[24]采用鄰苯二甲醛（OPA）、FMOC聯(lián)合柱前衍生HPLC測定地龍中的游離氨基酸及水解氨基酸的含量，結(jié)果各氨基酸在26 min內(nèi)均得到較好分離，適宜于地龍藥材中氨基酸的快速測定。

4 幾種衍生化方法比較

適宜的衍生化方法是柱前衍生化試驗成功的關(guān)鍵步驟，衍生化程度完全與否影響試驗結(jié)論的正確性。衍生化的內(nèi)容一般包括衍生化試劑組成、衍生化時間、溫度等幾種常用衍生化方法的比較見表1。

5 幾種衍生化樣品檢測方法比較

不同的衍生化方法得到的衍生物，因其本身的性質(zhì)不同，需選擇適宜的流動相以及檢測器，主要包括檢測波長、流動相、柱溫、檢測器等條件。幾種常見的衍生化樣品的檢測方法見表2。不同的實驗室、操作人員、儀器設(shè)備可能在同樣的檢測條件下會得到不同的檢測結(jié)果，試驗時應(yīng)根據(jù)實際情況對上述檢測條件進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

表1 幾種常見的衍生化方法比較

表2 幾種常見的衍生化樣品檢測方法比較

6 結(jié)語

與柱后衍生化方法相比較，柱前衍生化分析的成本低、靈敏度高、分析時間短，適宜于中藥材中氨基酸類成分的分析。但衍生化過程中，形成的副產(chǎn)物可能對樣品色譜分離造成影響，或有可能產(chǎn)生雜質(zhì)或引入干擾峰，或步驟煩瑣易造成樣品損失。由于中藥材的成分復(fù)雜，在實際應(yīng)用時，需要根據(jù)試驗需求選擇合適的衍生試劑和衍生方法。

衍生化試劑對反相色譜柱的傷害較大，進(jìn)行樣品檢測時，應(yīng)盡量除去樣品中殘留的衍生化試劑，或使用預(yù)柱加以保護(hù)，并及時沖洗色譜柱，以延長色譜柱的使用壽命。

由于全球氣候大環(huán)境的改變，許多動物都瀕臨滅絕，在我國已應(yīng)用多年、療效顯著的貴重動物藥資源如犀角、虎骨等也逐漸短缺，市面上以次充好的現(xiàn)象屢見不鮮。而且部分動物藥在中藥復(fù)方制劑中作為君藥使用，其質(zhì)量的優(yōu)劣很大程度上影響了藥物的療效以及中藥材及其復(fù)方制劑的國際化步伐。因此，動物藥的質(zhì)量控制非常關(guān)鍵。

動物藥中氨基酸類成分的控制雖然可在一定程度上評價藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，在藥材的鑒別方面可以起到輔助作用，但并不能代表藥材中蛋白質(zhì)、肽類成分的整體質(zhì)量。另外，應(yīng)用于臨床療效顯著的動物藥，由于藥物本身的復(fù)雜性，目前存在藥物成分不明確、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少等問題。因此，需要將多種科學(xué)手段聯(lián)合起來，以多種成分的有效控制共同表征藥材的質(zhì)量，擴(kuò)大藥物的適應(yīng)證，為中藥材走向國際化打好基礎(chǔ)。

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