食管鱗狀細(xì)胞癌組織中uPA和PAI-1表達(dá)與浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系研究

朱麗娟， 陳 曉, 蒲紅偉， 李曉梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室, 烏魯木齊 830011， 2臨床醫(yī)學(xué)研究院, 烏魯木齊 830054， 3高職學(xué)院, 烏魯木齊 830011)

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是世界上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一, 在我國每年大約有24萬食管癌新發(fā)病例[1], 據(jù)統(tǒng)計(jì)其5年生存率為3.5%～13.9%[2]。在新疆，食管癌死亡率為13.05/10萬, 其中哈薩克族(哈族)死亡率為68.88/10萬, 嚴(yán)重威脅著人們的健康[3]。自1976年有研究報(bào)道尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)存在于人卵巢腫瘤細(xì)胞中以來，uPA與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系逐漸受到人們的關(guān)注，其廣泛存在于人體多種腫瘤組織細(xì)胞中，在惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平高于其相應(yīng)的正常組織[4-5]。uPA系統(tǒng)可能通過多種途徑對消化道腫瘤的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等進(jìn)行調(diào)節(jié)，與單核細(xì)胞激活抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生有關(guān)[6]。纖溶酶原激活物抑制劑I(PAI-1)是一種糖蛋白，表達(dá)在各種各樣的細(xì)胞類型中如血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞中[7-8]，與正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞間的作用有所差別，能調(diào)節(jié)后者的吞噬作用，作為有效的特異性u(píng)PA抑制劑，參與uPA/uPAR/PAI-1復(fù)合物形成，阻止細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過分降解，從而具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[9]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)聯(lián)合檢測uPA和PAI-1在80例ESCC中的表達(dá)水平，旨在探討兩者表達(dá)與食管癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料選取1997-2004年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的ESCC標(biāo)本80例，其中哈薩克族40例，漢族40例，男性57例，女性23例，年齡46～77歲，平均60歲。所有病例術(shù)前未經(jīng)任何放療和化療。按照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)：中高分化46例，低分化34例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。同時(shí)選取20例食管癌旁正常組織作為對照。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚度，連續(xù)切片4張。uPA鼠抗人單克隆抗體(濃縮型)購自美國Santa Cruz公司、鼠抗PAI-1單克隆抗體購自美國Abcam公司，SP免疫組化試劑盒、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.2方法采用免疫組織化學(xué)Envision二步法檢測各組織中蛋白的表達(dá)。步驟如下：石蠟切片逐級(jí)脫蠟、水化至水，用30 mL/L H2O2室溫下孵育20 min(封閉內(nèi)源性過氧化物酶)，PBS漂洗。將切片置于pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中,微波爐加熱修復(fù)抗原20 min(溫度控制在95℃～100℃)，取出自然冷卻至室溫后，用PBS漂洗。滴加一抗，置于濕盒內(nèi)，4℃冰箱過夜。同法沖洗切片，DAB顯色，置于濕盒中，自來水終止顯色反應(yīng)，切片蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化返藍(lán)，脫水封片。

1.3結(jié)果觀察uPA、PAI-1以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒顆粒為陽性染色細(xì)胞。在400倍視野下每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，陽性細(xì)胞<5%為陰性，>5%為陽性[10]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析、Cox回歸模型，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1uPA、PAI-1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常食管組織中的表達(dá)uPA在食管癌組織和正常黏膜組織中陽性表達(dá)率分別為75.0%和45.0%，PAI-1在食管癌組織和正常黏膜組織中陽性表達(dá)率分別為75.0%和10.0%，在食管癌組織中uPA、PAI-1蛋白表達(dá)顯著高于食管正常黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 uPA蛋白及PAI-1蛋白在食管癌組織和正常食管組織表達(dá)結(jié)果/例(%)

2.2uPA、PAI-1與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系uPA、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PAI-1蛋白表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隨著浸潤深度的增加, uPA、PAI-1蛋白表達(dá)陽性率也逐漸增高，肌層和漿膜層兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在不同的腫瘤大小組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；漢族和哈薩克族患者uPA的表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 uPA蛋白及PAI-1蛋白與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系/例(%)

2.3uPA和PAI-1的表達(dá)相關(guān)性PAI-1和uPA 表達(dá)均為陰性為23例，PAI-1和uPA 表達(dá)均為陽性的為28例，PAI-1陽性和uPA陰性5例，PAI-1陰性和PAI-1陽性27例。uPA和PAI-1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=7.092,P<0.05),見表3。

表3 uPA和PAI-1表達(dá)的相關(guān)性/例

2.4單因素Kaplan-Meier生存分析80例ESCC患者中16例存活，中位生存期為60個(gè)月(生存期6～80個(gè)月)，10年生存率為20%(16/80)。陽性表達(dá)組平均生存時(shí)間和中位生存時(shí)間均高于陰性表達(dá)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、2)。

2.5多因素分析以患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、病變長度、病理類型以及食管癌中uPA和PAI-1蛋白的表達(dá)為變量，進(jìn)行Cox多因素回歸分析。結(jié)果顯示，獨(dú)立的預(yù)后因素為患者腫瘤浸潤深度和轉(zhuǎn)移(表4)。

圖1 uPA表達(dá)陰性和陽性表達(dá)組生存曲線

圖2 PAI-1表達(dá)陰性和陽性表達(dá)組生存曲線

表4 食管癌預(yù)后的Cox模型多因素分析

3 討論

Gosciski等[11]研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，uPA陽性表達(dá)率明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者，uPA表達(dá)陽性越高的食管鱗癌患者腫瘤侵襲力越強(qiáng)，且與腫瘤生長方式、浸潤深淺、淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提出uPA可能參與食管鱗癌的發(fā)生與發(fā)展，參與腫瘤組織血管形成，利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。韓艷春等[12]對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中uPA表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，uPA 在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，與乳腺癌的TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。本研究顯示，uPA蛋白表達(dá)與食管鱗癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度相關(guān)，但與分化程度、病理分型等關(guān)系不明顯，證實(shí)了uPA蛋白表達(dá)與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對于腫瘤發(fā)展起重要作用。

錢璞等[13]發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血漿PAI-l濃度與TNM分期有關(guān)，Ⅳ期高于Ⅲ期，可能與胰腺癌病情發(fā)展晚期，PAI-l降解細(xì)胞外基質(zhì)加速和PAI-l濃度過高有關(guān)。姜琳等[14]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中PAI-l的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織中的表達(dá)水平，與胰腺癌的臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān), 而與腫瘤大小、病理分化等均無關(guān)，這些與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子等物質(zhì)促進(jìn)腫瘤血管生成、基質(zhì)浸潤、腫瘤細(xì)胞脫落、淋巴轉(zhuǎn)移等過程導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究中，PAI-1蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)，提示PAI-1蛋白表達(dá)與食管癌的發(fā)展有一定關(guān)系。

Borstnar等[15]研究發(fā)現(xiàn)，uPA及PAI-1的血液濃度越高，對抗癌藥越敏感，認(rèn)為可作為化療療效指標(biāo)。提示uPA及PAI-1有可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。孟麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌組織中uPA與PAI-1表達(dá)水平及uPA與PAI-1血清值均顯著高于子宮內(nèi)膜增生組及正常子宮內(nèi)膜組織，并且其與子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期、組織學(xué)分級(jí)及其浸潤轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果表明uPA、PAI-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，其在食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移中可能具有協(xié)調(diào)作用。這可能與PAI-1對uPA的直接抑制作用無關(guān)，具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。通過Kaplan-Meier生存分析顯示，PAI-1陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組相比，后者5年生存率較前者高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步做Cox多因素回歸分析，結(jié)果uPA、PAI-1與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，不能獨(dú)立影響食管鱗癌預(yù)后，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳建國,陸建華.國內(nèi)外癌癥防治現(xiàn)狀[J].腫瘤,2007,27(9):755-759.

[2] 陳建國,朱健,張永輝.啟東市1972-2000年主要惡性腫瘤生存分析[J].中國腫瘤, 2006,15(9):575-578.

[3] 呂秀平,蒲紅偉,龔曉瑾,等.MALDI-TOF-MS分析新疆食管鱗狀細(xì)胞癌的蛋白組學(xué)[J].世界華人消化雜志，2011,19(36):3682-3686.

[4] Witzel ID, Midel-Langosch K, Witzl RM, et al. Comparison of microarray based RNA expression with ELISA-based protein determinination of HER-2 uPA and PAI-1 in tumor tissue of patients with breast cancer and relation to outcome [J]. J Cancer Ras Clin Oncol, 2010, 36 (11):1709-1718.

[5] Yong HY, Kim, IY, Kim JS, et al. ErbB2-enhanced invasiveness of H-Ras MCF 10A breast cells requires MMP13 and uPA up-regulation Via p38 MAPK signaling[J]. Int Oncol，2010, 36(2):501-507.

[6] Salas AL, Montezuma TD, Farina GG, et al. Genistein modifies liver fibrosis and improves liver function by inducing uPA expression and proteolytic activity in CCL4-treated rats[J]. Pharmacology, 2008, 81(1):41-49.

[7] Ha H, Oh EY, Lee HB, et al. The role of plasminogen activator inhibitor 1 in renal and cardiovascular diseases [J]. Nat Rev Nephrol，2009, 5(2):203-211.

[8] Hultman K, Blomstrand F, Nilsson M,et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 and protease nexin-1 in human astrocytes:response to injury-related factors[J]. J Neurosci Res, 2010, 88(11):2441-2449.

[9] Hyejin J, Jong-Heon K, Jae-Hong K, et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 regulates microglial motility and phogacytic activity[J]. J Neuroinflammat, 2012, 9(1):149-156.

[10] 馬紅,陳 曉,馬海梅,等.E-cadherin 和B-catenin 在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(5):534-536.

[11] Goscinski MA, Suo ZH, Nesland JM, et al. Dipeptidyl peptidase IV expression in cancer and stromal cells of human esophageal squamous cell carcinomas, adenocarcinomas and squamous cell carcinoma cell lines[J].APMIS, 2008, 116(9):823-831.

[12] 韓艷春,劉魯英,王霞,等.乳腺癌組織中VEGF-C和uPA的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2010,26(3):296-299.

[13] 錢璞,盧志賢,楊春香.胰腺癌患者血漿PAI-1測定的臨床意義[J].放射免疫學(xué)雜志，2012,25(5):559-560.

[14] 姜琳,孫燦林,李慧,等.胰腺癌組織中Smad7、uPA及PAI-1的表達(dá)及臨床意義[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2010,20(6):527-531.

[15] Bofstnar S，Sadikov A，Mozina B, et al. High levels of uPA and PAI-1 predict a good response to anthracyelines [J].Breast Cancer Res Treat, 2010, 121(3):615-624.

[16] 孟麗,山峰,劉相萍,等.子宮內(nèi)膜癌組織uPA和PAI-1 mRNA表達(dá)及其意義[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,44(3):241-243.