輔助發(fā)酵劑加速Provolone干酪成熟的研究

徐瑤，楊威，趙彥星，張東京，趙征

(天津科技大學(xué)，天津 300457)

0 引 言

Provolone(波蘿伏洛)干酪是一種意大利半硬質(zhì)干酪，消費(fèi)前需經(jīng)過成熟[1]。因而，干酪促熟具有很大的經(jīng)濟(jì)價值。近年來，干酪原料乳中微生物數(shù)量很低，低溫巴氏殺菌使原料乳幾乎達(dá)到了無菌狀態(tài)[2]，一些利于產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的非發(fā)酵菌數(shù)量隨之降低。為此，人們開始研究輔助發(fā)酵劑。輔助發(fā)酵劑(Adjunct Cultures)主要是非發(fā)酵劑乳酸菌(NSLAB)，是一類經(jīng)篩選、特意添加到新鮮干酪中的微生物，可提高干酪的感官品質(zhì)并加快其成熟[3-4]。瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)蛋白水解活力較強(qiáng)，能加速干酪成熟，并減少苦味肽的產(chǎn)生[5-6]。

本文將瑞士乳桿菌6024作為輔助發(fā)酵劑加速Provolone干酪的成熟，為輔助發(fā)酵劑加速干酪成熟提供一定的依據(jù)及可行性。

1 實 驗

1.1 材料及設(shè)備

瑞士乳桿菌6024，脫脂乳粉(新西蘭進(jìn)口)，生鮮牛乳，發(fā)酵劑(DELVO-TEC MT-53A)；米黑根毛霉凝乳酶(FROMASE 750XLG)。

活性炭；百里香酚酞；氫氧化鈉；中性甲醛；乙醇；乙醚；氫氧化鉀；酚酞；壬烷；無水硫酸鈉。

生化培養(yǎng)箱；拉伸機(jī)；離心機(jī)；質(zhì)構(gòu)儀；掃描電子顯微鏡；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 菌株的活化

將保存的菌株進(jìn)行3次以上的活化培養(yǎng)以恢復(fù)活力，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%脫脂乳培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)至凝乳，置于4℃冰箱備用。

1.3 Provolone干酪的制作

原料乳驗收→巴氏殺菌 (63℃，30 min)→冷卻→加發(fā)酵劑→發(fā)酵→加氯化鈣→發(fā)酵終點(diǎn)時實驗組加入1%瑞士乳桿菌→加凝乳酶→凝塊切割→加熱攪拌→排乳清→堆釀→加鹽→拉伸(中心溫度55℃)→腸衣包裝→成熟(10℃，90 d)

1.4 Provolone干酪成熟期間游離氨基酸的測定

游離氨基酸(FAA)是干酪中蛋白質(zhì)水解的主要產(chǎn)物，測定干酪中FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)能進(jìn)一步說明成熟過程中蛋白質(zhì)的水解情況，是干酪成熟過程中的一個主要指標(biāo)。同時這些降解產(chǎn)物對于干酪風(fēng)味的形成非常重要。

干酪中的游離氨基酸的測定采用甲醛法進(jìn)行測定。具體操作如下：

稱取樣品5.00～10.00 g于燒杯中，加入50 mL蒸餾水、約5 g活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40 mL熱水洗滌活性炭，收集濾液，加3～5滴百里香酚酞，用濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色。加入20 mL中性甲醛，搖勻，靜置1 min，此時藍(lán)色已消失，再用濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色。記錄第二次滴定時所消耗的堿液毫升數(shù)。

計算公式如下：

氨基酸態(tài)氮(μg/g)=N×V×0.014/W×106，

式中：N為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；V為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量(第二次)；W為樣品溶液相當(dāng)于樣品的量；0.014為氮的毫克當(dāng)量。

1.5 Provolone干酪成熟期間游離脂肪酸的測定[7]

(1)稱取1.00 g樣品，加入25 mL乙醇乙醚溶液，將干酪充分磨碎，移入離心管中，再用25 mL的溶液充分沖洗，將所有溶液移入離心管內(nèi)，離心(4 000 r/min，20 min)，將上清液移入三角瓶中，加入3滴酚酞指示劑，用標(biāo)定的濃度為0.1 mol/L氫氧化鉀乙醇溶液滴至粉紅色，15 s不褪色，記錄體積。

(2)計算

游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) (以油酸計)=[(V×N×282)/(W×1000)]×100%，

式中：V為所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；N為所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度；282為油酸的相對分子質(zhì)量；W為樣品的質(zhì)量。

1.6 干酪成熟期間質(zhì)構(gòu)特性

干酪樣品用打孔器處理成圓柱形，直徑20 mm，厚度10 mm，取樣后至測試前均統(tǒng)一放置于0～4℃冰箱中，防止溫度對產(chǎn)品質(zhì)地產(chǎn)生影響。

采用質(zhì)構(gòu)儀，以TPA二次下壓法測定干酪的硬度和彈性。具體參數(shù)：測試前探頭下降的速度為5.0 mm/s：測試中探頭下降的速度為1.0 mm/s；測試后探頭回程速度為1.0 mm/s；壓縮比為45%；兩次壓縮間隔時間為5 s；觸發(fā)力為5.0 g；探頭直徑和類型為P/36R。

1.7 干酪微觀結(jié)構(gòu)的測定

將樣品切成8 mm×2 mm×1 mm的小塊，每個樣2～3個平行，用2.5%的戊二醛進(jìn)行固定，放置在4℃冰箱中進(jìn)行過夜。然后用pH7.3的磷酸緩沖液沖洗三次，每次10 min。再分別用體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，90%，100%的乙醇進(jìn)行脫水，每次10 min,用氯仿脫脂2 h，間隔搖晃。最后冷凍干燥，粘臺，鍍金，觀察。

1.8 干酪風(fēng)味物質(zhì)的測定

應(yīng)用GC-MS測定Provolone干酪成熟60 d、90 d時揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，以匹配度確定化合物名稱，以壬烷為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行半定量分析[8-9]。

(1)樣品處理方法

取1.500 g奶酪樣品，加等量的無水Na2SO4混合均勻，迅速將樣品裝入15 mL的樣品瓶內(nèi)，并加入40 μg壬烷作為內(nèi)標(biāo)，加蓋封口。在60℃水浴中平衡30 min，頂端插入PDMS/DVB萃取頭，于60℃水浴萃取30 min后，用GC-MS分析。

(2)色譜和質(zhì)譜條件

①色譜條件

分離柱為VF-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為He；載氣流速為1.0 mL/min；程序升溫為40℃，3 min；以5℃/min至140℃；以10℃/min升至240℃，保持8 min。

②質(zhì)譜條件

離子源溫度為220℃；傳輸線溫度為280℃；離子化模式為EI；電子能為70 eV；掃描范圍為43～500(amu)；數(shù)據(jù)采集：全掃描。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Provolone干酪成熟期間游離氨基酸的測定

干酪成熟期間游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化如圖1所示。

圖1 干酪成熟期間游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

隨著成熟時間的延長，干酪中的酪蛋白不斷降解為多肽，多肽降解為游離氨基酸，這些降解過程同時發(fā)生。酪蛋白降解為多肽是通過凝乳酶和細(xì)菌內(nèi)蛋白酶完成，只有細(xì)菌酶才能進(jìn)一步降解多肽生成游離氨基酸，而凝乳酶不能降解個體氨基酸分子。由圖1可以看出，兩組干酪中的游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈上升趨勢，成熟60 d時，實驗組游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了對照組90 d時的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，90 d時兩組干酪游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著 (P＜0.05)，說明瑞士乳桿菌6024作為輔助發(fā)酵劑能顯著增加干酪中游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，加速蛋白質(zhì)降解。

2.2 干酪成熟期間游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

干酪成熟期間游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化如圖2所示。

在干酪成熟期間，脂肪水解是重要的生化反應(yīng)之一，脂肪在微生物和酶等的作用下發(fā)生緩慢水解，產(chǎn)生游離脂肪酸(FFA)。由圖2可以看出，隨著成熟時間的延長，干酪中的脂肪不斷降解，兩組干酪中游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈上升趨勢但差異不顯著性 (P＞0.05)，說明瑞士乳桿菌6024作為輔助發(fā)酵劑對干酪脂肪降解無顯著性影響。

圖2 干酪成熟期間游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

2.3 干酪成熟期間質(zhì)構(gòu)特性分析

干酪成熟期間硬度和彈性變化分別如圖3和圖4所示。

圖3 干酪成熟期間硬度變化

圖4 干酪成熟期間彈性變化

干酪成熟期間蛋白質(zhì)、脂肪發(fā)生水解，肽鍵斷裂，酪蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，硬度、彈性隨之下降，干酪質(zhì)地表現(xiàn)出了成熟特征。由圖3和圖4可以看出，隨著成熟時間的延長，兩組干酪的硬度、彈性均呈下降趨勢。實驗組干酪60 d時硬度(7001.260)、彈性(0.823)與實驗組90 d時(6996.866，0.825)相比差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 干酪成熟期間微觀結(jié)構(gòu)的測定

干酪成熟期間微觀結(jié)構(gòu)變化如圖5所示。

由圖5可以看出，干酪體系中均勻分布一個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，類似于海綿結(jié)構(gòu)，其中酪蛋白結(jié)合聚集，沒有明確方向，隨著成熟時間的不斷延長，兩種干酪的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，實驗組干酪60 d時微觀結(jié)構(gòu)與對照組90 d時微觀結(jié)構(gòu)相似，形成了更大的分子空穴，蛋白膠束變得更加纖細(xì)。

圖5 干酪成熟期間微觀結(jié)構(gòu)變化

2.4 干酪成熟期間風(fēng)味物質(zhì)測定

兩組干酪成熟60 d和90 d時風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果分別如表1和表2所示。

表1 干酪成熟60 d時揮發(fā)性化合物種類及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表2 干酪成熟90 d時揮發(fā)性化合物種類及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表1和表2可以看出，成熟60 d時，實驗組干酪共分離鑒定出10種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，分別為醛類1種，酮類2種，烴類3種，醇類4種，其中烴類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，揮發(fā)性風(fēng)味化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.991 μg·g-1；對照組干酪共分離鑒定出12種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，分別為醛類2種，酮類2種，烴類3種，醇類5種，其中酮類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，揮發(fā)性風(fēng)味化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.990 μg·g-1。

成熟90 d時，實驗組干酪共分離鑒定出13種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，分別為醛類1種，酮類3種，烴類3種，醇類2種，酯類1種，呋喃類1種，酚類2種，其中酮類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，揮發(fā)性風(fēng)味化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.996 μg·g-1；對照組干酪共分離鑒定出13種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，分別為醛類1種，酮類3種，烴類4種，醇類2種，酯類1種，酚類2種，其中醇類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，揮發(fā)性風(fēng)味化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.996 μg·g-1。

隨著成熟時間的延長，干酪的風(fēng)味物質(zhì)種類不斷增加。與成熟90 d對照組干酪相比，實驗組干酪成熟60 d時風(fēng)味物質(zhì)種類少兩種，但總量沒有顯著差異。

3 結(jié) 論

瑞士乳桿菌6024作為輔助發(fā)酵劑添加到Provolone干酪中，對干酪中游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著影響，但能顯著增加干酪游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，加速蛋白質(zhì)降解，60 d時達(dá)到對照組90 d時的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，此時干酪的質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)、風(fēng)味物質(zhì)均與對照組90 d時差異不顯著。由此可知，瑞士乳桿菌6024作為輔助發(fā)酵劑可加速Provolone干酪的成熟，縮短成熟時間。

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