乳鐵蛋白熱穩(wěn)定性研究

閆序東，王彩云，云戰(zhàn)友

(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，呼和浩特010110)

0 引 言

乳鐵蛋白(LF)對(duì)熱敏感，容易變性失活。關(guān)于乳鐵蛋白的熱穩(wěn)定性，已有一些研究報(bào)道。HIROAKI等[1]研究了在酸性條件下牛乳鐵蛋白的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)脫鐵乳鐵蛋白在酸性條件下非常穩(wěn)定。CELIA等[2]研究了熱對(duì)LF抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)85℃保溫10 min的熱處理強(qiáng)度未降低LF的抑菌活性。LUIS等[3]研究發(fā)現(xiàn)72℃保溫20 s或135℃保溫8 s的熱處理?xiàng)l件幾乎不影響LF的鐵結(jié)合能力，然而兩種溫度下更長(zhǎng)的時(shí)間則會(huì)降低鐵結(jié)合能力。MARIE等[4]研究了不同鐵飽和度的LF在巴殺和UHT后的結(jié)構(gòu)和抑菌活性變化，發(fā)現(xiàn)UHT造成LF的完全變性和抑菌性喪失，而巴殺對(duì)LF的抑菌活性沒(méi)有影響。

通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道可知，乳鐵蛋白對(duì)熱敏感，在其生產(chǎn)及應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)注意保護(hù)其活性，以免失去功效。但以往的研究結(jié)果存在一些分歧甚至矛盾，因此有必要研究LF在乳制品加工常用熱處理?xiàng)l件下的熱穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)LF在實(shí)際加工過(guò)程中的結(jié)構(gòu)和生物活性變化。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

乳鐵蛋白，E.coli K99，ANS試劑，DTNB； 磷酸二氫鈉、SDS、丙烯酰胺等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

UHT設(shè)備，水浴恒溫振蕩器，熒光分光光度計(jì)，電泳儀，TV-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 熱處理

以蒸餾水溶解乳鐵蛋白，配制為40 g/L(質(zhì)量濃度)的乳鐵蛋白溶液，進(jìn)行不同強(qiáng)度的熱處理，熱處理?xiàng)l件分別為：63 ℃/30 min，72 ℃/15 s，85 ℃/15 s，85℃/10 min，95 ℃/5 min和 138 ℃/4 s，138 ℃/4 s的受熱條件以UHT設(shè)備處理，其他受熱條件在水浴鍋中處理。熱處理后將乳鐵蛋白溶液冷凍備用。

1.2.2 濃度測(cè)定

采用還原SDS-PAGE和非還原SDS-PAGE分別測(cè)定熱處理前后的乳鐵蛋白質(zhì)量濃度變化。非還原SDS-PAGE與還原SDS-PAGE相比未加β-巰基乙醇。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，上樣量3.3 μg，恒壓120V。

1.2.3 表面疏水性測(cè)定

ANS方法[5]，以0.01 mol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液將乳鐵蛋白配制成0.01～0.4 mg/mL的濃度，取不同濃度的蛋白溶液3 mL，加入40 μL的ANS溶液(以濃度為0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制的濃度為8 mmol/L的ANS溶液)，以熒光分光光度計(jì)在380 nm激發(fā)波長(zhǎng)、480 nm發(fā)射波長(zhǎng)，狹縫均為5 nm的條件下測(cè)定熒光值，以熒光值對(duì)蛋白質(zhì)濃度做出曲線并外推至蛋白濃度為0，曲線初始部分的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.2.4 游離巰基測(cè)定

參考BEVERIDGE的方法[6]，將LF蛋白樣品進(jìn)行適度稀釋，取稀釋樣品1 mL加入2.0 mL Tris-甘氨酸緩沖溶液(pH8.0)和0.02 mL的Ellman試劑(采用Tris一甘氨酸緩沖溶液(pH8.0)配制的濃度為4 g/L DTNB，25℃保溫5 min，412 nm下測(cè)定吸光度值。以不加樣品，而加Ellman試劑為空白，以不加Ellman試劑，而加樣品溶液測(cè)其混濁度，巰基量的計(jì)算：

-SH(μmol/g)=(75.53×A412×D)/C，

式中：A412=加DTNB時(shí)樣品的吸光度-不加DTNB時(shí)樣品的吸光度；D為稀釋倍數(shù)；C為樣品固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 鐵結(jié)合能力測(cè)定

參考盧蓉蓉方法[7]，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的LF溶液，取0.9 mL此溶液，與0.1 mL新鮮配制濃度為0.1 mol/L的NaHCO3溶液混合，并與1.0 mL濃度為0.6 mmol/L的Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O的(含0.01 mol/L的HCl)溶液混合。在25℃下反應(yīng)10 min，于465 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)。因?yàn)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵飽和的LF(Fe-LF)的A465為0.57，因此鐵結(jié)合能力=A/0.57×100%。

1.2.6 抑菌性測(cè)定

將E.coli K99活化兩代，第一代活化16 h，第二代活化1 h，再稀釋10倍備用。將熱處理后的40 mg/mL乳鐵蛋白溶液融化進(jìn)行測(cè)試，8.5 mL緩沖蛋白胨水中加入0.5 mL乳鐵蛋白溶液和1 mL菌液，于37℃，65 r/min水浴振蕩搖床中培養(yǎng)，每2 h測(cè)定一次600 nm下的OD值，培養(yǎng)至第24 h時(shí)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 濃度

熱處理前后LF的還原和非還原電泳結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，非還原電泳可以很好的反映乳鐵蛋白受熱損失的情況。63℃(30 min)的熱處理后，LF形成了少量的聚集體，這種聚集體不能進(jìn)入分離膠，但可以進(jìn)入濃縮膠。72℃(15 s)的熱處理?xiàng)l帶與未熱處理的LF幾乎相同，這種熱處理?xiàng)l件對(duì)LF造成的損害是最小的。85℃(15 s)熱處理后LF也形成了少量不能進(jìn)入分離膠的聚集體，但聚集體的數(shù)量少于63℃(30 min)的。 而85 ℃(10 min)和95 ℃(5 min)熱處理后，LF除形成了不能進(jìn)入分離膠的聚集體外，還形成了更大的不能進(jìn)入濃縮膠的聚集體，95℃(5 min)對(duì)LF造成的損失明顯高于85℃(10 min)。UHT后LF幾乎全部形成了很大的聚集體，這種聚集體全部不能進(jìn)入濃縮膠，而且形成這種聚集體的作用不能被β-巰基乙醇所破壞，因此還原電泳圖中UHT條帶與非還原電泳中相似。UHT外的其他熱處理形成的LF聚集物都能被β-巰基乙醇還原為單體蛋白。

圖1 熱處理前后LF的SDS-PAGE

2.2 表面疏水性

熱處理前后LF的表面疏水性如圖2所示。

圖2 熱處理前后LF的表面疏水性

蛋白質(zhì)的表面疏水性對(duì)于蛋白質(zhì)的溶解性、乳化起泡能力具有十分重要的作用。由圖2可以看出，熱處理對(duì)于LF的表面疏水性影響很大，熱處理有助于LF表面疏水性的增大，說(shuō)明熱處理后LF結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使更多原本折疊埋藏在分子內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露到分子表面。

2.3 游離巰基

熱處理前后LF的游離巰基數(shù)量如圖3所示。

圖3 熱處理前后LF的游離巰基數(shù)量

天然未變性的LF分子內(nèi)有17個(gè)二硫鍵，但沒(méi)有游離的巰基。由圖3可以看出，85℃(10 min)的熱處理后LF游離巰基數(shù)量略有上升，95℃(5 min)和UHT后，游離巰基數(shù)量增加很多，其他熱處理?xiàng)l件下，LF的游離巰基數(shù)量與未加熱前近似。這表明比較強(qiáng)烈的熱處理打斷了LF分子內(nèi)的二硫鍵從而釋放出游離的巰基，因?yàn)槎蜴I對(duì)于維持蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)非常重要，因此可以判斷二硫鍵的破壞必然伴隨著LF分子結(jié)構(gòu)的巨大改變。

2.4 鐵結(jié)合能力

熱處理前后LF的鐵結(jié)合能力如圖4所示。

圖4 熱處理前后LF的鐵結(jié)合能力

由圖4可以看出，溫度85 ℃(10 min)、95 ℃(5 min)和UHT處理后，LF的鐵結(jié)合能力受到明顯損害，其他熱處理?xiàng)l件下鐵結(jié)合能力下降不大。圖4中顯示的UHT處理后鐵結(jié)合能力反而高于95℃(5 min)是因?yàn)閁HT處理后LF溶液渾濁度增加很多，因此對(duì)于鐵結(jié)合能力的檢測(cè)結(jié)果干擾較大。

2.5 抑菌性

熱處理前后LF對(duì)大腸桿菌K99抑制作用的OD曲線如圖5所示，平板計(jì)數(shù)得到抑菌率如圖6所示。

圖5 熱處理前后LF對(duì)大腸桿菌K99抑制作用的OD曲線

圖6 熱處理前后LF對(duì)大腸桿菌K99抑制作用的24 h抑菌率

由圖5和圖6可以看出，常規(guī)的乳制品巴殺操作對(duì)乳鐵蛋白抑菌活性的影響不大，而85℃(10 min)及更強(qiáng)的熱處理強(qiáng)度會(huì)降低乳鐵蛋白的抑菌活性。

3 結(jié)束語(yǔ)

乳鐵蛋白是熱敏性物質(zhì)，乳制品加工中的各種常規(guī)熱處理都會(huì)或多或少造成乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)或生物活性的改變，乳鐵蛋白所遭受的熱處理強(qiáng)度越高，則變性和失活的程度也越高。特別是乳鐵蛋白在遭受UHT等強(qiáng)熱處理后，其特征電泳條帶損失很大，自由巰基和表面疏水性變化也指示乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變，同時(shí)鐵結(jié)合能力和抑菌活性這兩大乳鐵蛋白主要的生物活性也降低很多。但巴氏殺菌對(duì)乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)及生物活性的影響較小。因此在乳鐵蛋白生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)該盡量減少乳鐵蛋白受到強(qiáng)度較高的熱處理，以保證乳鐵蛋白的優(yōu)良生物活性得到較好保留。

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[7]盧蓉蓉.乳鐵蛋白的分離、純化及其生物活性功能[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2003.