發(fā)酵駝乳源生物活性肽的提取分離和免疫調(diào)節(jié)活性評(píng)價(jià)

巴合提·烏拉孜別克，劉紅梅，新華·那比

(新疆醫(yī)科大學(xué) a.藥理教研室；b.高職學(xué)院機(jī)能教研室,烏魯木齊 830011)

0 引 言

發(fā)酵制品食用在中亞具有悠久歷史，是哈薩克族及蒙古族等游牧民族常作為藥食兼用的功能性食品。本課題組歷盡十年研究發(fā)現(xiàn)乳酪乳清(哈族傳統(tǒng)制作的發(fā)酵食品)富含益生菌及生物活性肽具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。發(fā)酵駝乳也是傳統(tǒng)乳飲品。民間用于輔助治療結(jié)核病和糖尿病[1]。

本課題組研究結(jié)果顯示發(fā)酵駝乳具有抗炎作用，可能與其免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)[2],免疫學(xué)發(fā)展使得食品中特定的天然功能因子對(duì)調(diào)節(jié)免疫功能、抵抗慢性炎癥和損傷的作用越來(lái)越清楚。利用食品功能因子調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)成為一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。本研究提取分離發(fā)酵駝乳中不同的組分，并研究其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的影響，為其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供初步的理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳樣品來(lái)源

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)昌吉州呼圖壁縣牧區(qū)。

1.1.2 動(dòng)物來(lái)源

體重20±2 g，雄性，昆明種小鼠[SCXK(新)2003-0001]購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.3 儀器與試劑

超濾裝置，超濾膜(內(nèi)壓式Ps-10，分子量截留值為10 000)；Sephadex G-50，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍干燥機(jī)，超凈操作臺(tái)，5%CO2培養(yǎng)箱；96孔培養(yǎng)板，RPMI-1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)，淋巴細(xì)胞分離液，胎牛血清(FBS)，磷酸緩沖溶液(PBS)，小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 乳清的分離及超濾

發(fā)酵駝乳以3 000 r/min，離心45 min，分離得到乳清。采用分子量截留值為10kua的超濾膜對(duì)乳清進(jìn)行超濾，并將超濾液濃縮，冷凍干燥得到粗品。

1.2.2 超濾物的凝膠層析

采用Sephadex G-50凝膠層析柱分離分子量10 ku以下粗品。首先用蒸餾水溶脹Sephadex G-50粉末，裝住，平衡。設(shè)柱體積：1.7 cm×85 cm,流動(dòng)相與洗脫液均為蒸餾水；超濾凍干粉質(zhì)量濃度為1 g/L。確定最佳流速與上樣量：(1)流速的選擇：0.3，0.5，0.8 mL/min對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，對(duì)照洗脫圖譜選擇合適的流速。(2)選擇上樣量為2，3.5，5 mL進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)照洗脫圖譜選擇合適的上樣量。進(jìn)行分離，每3 mL收集液在紫外檢測(cè)器測(cè)定214 nm處吸收值，合并出峰時(shí)間相同收集液，濃縮，冷凍干燥，保存于-20℃。

1.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備[3]

取(20±2)g，雄性，昆明小鼠眼球放血，處死，無(wú)菌超凈臺(tái)上取出脾臟，置200目尼龍篩上,用無(wú)菌注射器芯研磨，過篩的細(xì)胞收集于盛有磷酸緩沖液(PBS)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。加入適量淋巴細(xì)胞分離液，在室溫下以2 000 r/min，水平離心30 min，用吸管吸取淋巴細(xì)胞云霧層移入另一離心管中，用PBS洗滌3次。重懸于含10%熱滅活胎牛血清，濃度為2.05 mmol/L左旋谷氨酰胺，0.1%青-鏈雙抗溶液的完全RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞懸液濃度調(diào)至1×105mL-1，并用胎盤藍(lán)溶液測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.4 各凝膠層析組分細(xì)胞增殖活性的評(píng)價(jià)[4]

分別設(shè)立空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(組分a，b，c，d)， 檢測(cè)不同組分對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。備好的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)上述每組6孔，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育4小時(shí)。將各凝膠層析組分溶于蒸餾水中，每組分備兩個(gè)質(zhì)量濃度(0.1,0.25 g/L和0.5g/L)，用0.22 μm慮膜過濾，加至實(shí)驗(yàn)組(100 μL/孔)。陽(yáng)性對(duì)照組加入終質(zhì)量濃度為5 mg/L的ConA(100 μL/孔)， 空白對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)液。繼續(xù)孵育44小時(shí)后，無(wú)菌，避光條件下每孔加入10 μL ccK-8溶液，再培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度(OD)，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。各組分對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)孔或陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/空白對(duì)照孔OD值[5]。

1.2.5 測(cè)定肽段C對(duì)淋巴細(xì)胞表達(dá)IFN-γ與IL-4水平的影響

采用酶聯(lián)免疫 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)法[6]評(píng)價(jià)肽段C對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞表達(dá)IFN-γ與IL-4的影響。按照1.2.4所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，以1 500 r/min離心10 mins細(xì)胞懸液，收集上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定細(xì)胞上清IFN-γ與IL-4質(zhì)量濃度。分別設(shè)提取物C組(0.1,0.25 g/L和0.5 g/L)，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±S表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析后進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠層析分離超濾物

離心發(fā)酵駝乳分離乳清，進(jìn)一步采用超濾法得到小于10 ku分子量的粗品，濃縮，冷凍干燥?？疾霺ephadex G-50柱分離條件并確定：流速0.5 mL/mim，上樣量2 mL。共得到4個(gè)組分，結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1 凝膠層析上樣量對(duì)組分分離的影響

圖2 凝膠層析流速對(duì)組分分離的影響

圖3 凝膠層析分離所得的各組分

2.2 各凝膠層系組分的促淋巴細(xì)胞增殖活性

發(fā)酵駝乳源生物活性物質(zhì)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響：與空白對(duì)照組比較，凝膠層析肽段c組(0.25，0.5 mg/L)OD值為0.58±0.014，0.59±0.018，(P＜0.05)， 淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)分別為1.26±0.015，1.3±0.010(P＜0.05)。說明肽段C脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著增高于空白組以及其余肽段刺激組。結(jié)果如表1和圖4所示。

表1 凝膠層析各組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率的影響(±s)

表1 凝膠層析各組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率的影響(±s)

注：*為與其他組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，n=6。下同。

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表2 凝膠層析各組分刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞指數(shù)(±s)

表2 凝膠層析各組分刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞指數(shù)(±s)

注：*為與其他組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，n=6。

組別肽段a肽段b肽段c肽段d空白ConA(5 mg/L)SI值(實(shí)驗(yàn)組OD/空白組OD)0.1 g/mL 0.97±0.024 0.99±0.020 1.01±0.021 0.99±0.047 0.25 g/mL 0.99±0.012 1.00±0.012 1.26±0.015*1.00±0.003 1.00±0.002 1.76±0.013*0.5 g/mL 1.01±0.014 0.98±0.017 1.30±0.010*0.99±0.001

圖4 各組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

表3 凝膠層析各組間小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)差異(x±s)

肽段c與其余各肽段之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

2.3 肽段C對(duì)淋巴細(xì)胞表達(dá)IFN-γ與IL-4水平的影響

ELISA法測(cè)得肽段C組和空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組IFN-γ與IL-4表達(dá)水平。組間比較，肽段C組IFN-γ含量相對(duì)于空白對(duì)照組明顯增高(P＜0.05)，而兩組IL-4表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，結(jié)果如表4所示。

表4 肽段C對(duì)細(xì)胞上清IFN-γ與IL-4含量的影響(±s)

表4 肽段C對(duì)細(xì)胞上清IFN-γ與IL-4含量的影響(±s)

注：*為與其他組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，n=6。

肽段c組0.1 g/L 0.25 g/L 0.5 g/L空白組ConA組IFN-γ 0.14±0.020 0.22±0.021觹0.23±0.015觹0.15±0.014 0.61±0.012觹IL-4 0.13±0.015 0.13±0.023 0.14±0.011 0.13±0.017 0.23±0.018觹

3 結(jié) 論

本研究主要針對(duì)發(fā)酵駝乳源生物活性肽的提取分離，并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法測(cè)定各肽段免疫調(diào)節(jié)活性。其免疫調(diào)節(jié)活性的評(píng)價(jià)即測(cè)定各肽段對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響[5]。細(xì)胞增殖性強(qiáng)弱反應(yīng)細(xì)胞生存能力與功能狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到生理性與病理性因素?fù)p傷，機(jī)體免疫力下降時(shí)，首先表現(xiàn)出增殖活性的降低。而細(xì)胞因子IFN-γ能促進(jìn)免疫應(yīng)答，是抗結(jié)核感染免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞因子[7]。

基于前期種種研究發(fā)現(xiàn)，本研究首先對(duì)發(fā)酵駝乳蛋白及小分子生物活性肽的部分提取工藝進(jìn)行考察，并更深入探討發(fā)酵駝乳蛋白及小分子生物活性物肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分發(fā)酵駝乳源生物活性肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的體外增值有一定的作用，并可以從細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)水平也可證明這一點(diǎn)，初步評(píng)價(jià)發(fā)酵駝乳在小鼠免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用。

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