牛、羊初乳中多肽的篩分比較及抗炎作用研究

張悅，葛武鵬，賈玉良，陳瑛，王遷，秦立虎

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局信息中心，西安 710006；3.陜西楊凌質(zhì)量技術(shù)檢測檢驗所，陜西 楊凌，712100；4.西安奶業(yè)科學(xué)研究所，西安 710065)

0 引 言

初乳所含營養(yǎng)物質(zhì)極為豐富[1]，其含有大量的免疫球蛋白和其他很多免疫成份，如肽類、激素、酶、糖及生長因子等[2]。食品中的功能成分小分子量的生物活性多肽(＜1 000 g/mol)[3]，它們是通過體內(nèi)胃腸消化或體外蛋白酶解后得到的具有生物活性的小的氨基酸序列[4，5]，顯示出很多特殊功能特性，如抗菌性，抗高血壓，免疫調(diào)節(jié)等[6]。

腫瘤壞死因子TNF-α已經(jīng)確定是與炎癥相關(guān)的支持因子，所以對于炎癥的治療策略是干預(yù)和降低TNF-α的濃度[7]，炎癥疾病困擾著人們，僅有報道稱乳鐵蛋白素具有抗炎作用[8]，但很少有研究報道關(guān)于乳中的多肽成分的抗炎作用。

因此，本研究旨在分離純化經(jīng)模擬人體消化后牛羊初乳中的多肽，并檢測了所獲多肽的抗炎功能特性。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 原料

牛、羊初乳樣品均為牛、羊產(chǎn)犢后第1天到第7天的乳；肽分離柱SuperdexTMPeptide 10/300GL；BV2神經(jīng)小膠質(zhì)細胞系。

1.1.2 試劑

Pepsin胃蛋白酶 (1∶10,000， 質(zhì)量濃度5 g/L濃度0.01 mol/L的HCl)和trypsin胰蛋白酶(1∶250,濃度為5 g/L,pH=7.0磷酸鹽緩沖液)，DMEM培養(yǎng)基 (粉劑)，雙抗(含青霉素及鏈霉素和左旋谷氨酰胺)，F(xiàn)BS(胎牛血清)，LPS脂多糖 (血清類型 055∶B5)，小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，乙酸，色譜純。

1.1.3 主要設(shè)備

AKTA PurifierTM10蛋白質(zhì)層析儀，680酶標儀，冷凍離心機，3111二氧化碳培養(yǎng)箱，IF-300-150制冰機，高壓立式蒸汽滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 乳樣品的預(yù)處理

將所有收集的牛、羊初乳樣品進行模擬人體胃腸消化處理。用濃度為1 mol/L的HCl使得蛋白質(zhì)量濃度在3 g/L，37 ℃，pH值為1.5預(yù)熱10 min，按照酶∶底物=1∶100的量加入胃蛋白酶溶液 (質(zhì)量濃度5 g/L，濃度為0.01 mol/l的HCl)37 ℃下消化30 min；用濃度為1 mol/L的NaOH調(diào)pH值到6.8停止消化；調(diào)整pH值至7.8，40℃水浴預(yù)熱10 min。按照酶∶底物=1∶30的量，加入胰蛋白酶溶液(質(zhì)量濃度5 g/L(pH=7.0)磷酸緩沖液)40℃消化1 h。8 000 r/min冷凍離心30 min,上清液冷凍干燥后備用。

1.2.2 應(yīng)用蛋白質(zhì)層析儀對乳樣品進行分離純化

上機前所有樣品要過0.22 μm的針頭濾器 (水系)，上樣量為1 mL。選擇專門分離多肽的柱子SuperdexTMPeptide 10/300GL，柱子內(nèi)徑10/床高300， 柱體積24 mL，平均顆粒13～15 μm，分離范圍100～7 000 u，耐壓為1.8 MPa，流速為1.2 mL/min。具體的分離純化步驟參照廠商說明書。首先用pH值為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液清晰柱子和泵1 h，再讓樣品過0.22 μm的針頭濾器(水系)后上樣1 mL，3種檢測波長280,254,215 nm的檢測器均打開是為選擇出最好的色譜圖，最后儀器配有同步自動收集器收集所分離純化出的樣品。

1.2.3 BV2細胞培養(yǎng)

BV2，小鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細胞系，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 (含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，2mM左旋谷氨酰胺，pH值為7.1～7.2)在37℃質(zhì)量分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，每隔2～3 d換培養(yǎng)基1次。

1.2.4 抗炎作用分析

選取BV2細胞培養(yǎng)上清液，分別加入1 μL分離純化出的每種多肽，再向其中加入能夠誘發(fā)炎癥的1 mg/L of LPS脂多糖，然后于無血清FBS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h。所選的ELISA試劑盒采用的是競爭法檢測樣品中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。向預(yù)先包被了抗體的酶標孔中加入樣品，再加入辣根過氧化物酶標記的識別抗原，在37℃下孵育1 h,兩者與固相抗原競爭結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBST洗滌后，結(jié)合的HRP催化TMB(四甲基聯(lián)苯胺)成藍色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450 nm波長下有吸收峰，吸光值與樣品中的抗原濃度成負相關(guān)。文中未做特別說明時，樣品質(zhì)量濃度為3.3 g/L。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

文中數(shù)據(jù)為3次平行測得值的平均值。采用SPSS統(tǒng)計軟件16.0在顯著性水平P=0.05下進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。ELISA試劑盒數(shù)據(jù)處理選擇ELISA數(shù)據(jù)處理軟件ELISACalc。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛、羊常乳經(jīng)模擬消化后的多肽分離純化比較

經(jīng)過模擬人體消化后，牛、羊常乳通過SuperdexTMPeptide 10/300GL肽分離柱的分離后的洗脫曲線如圖1所示。其中，圖1(a)表示牛常乳的分離出的各組分多肽的峰，圖1(b)表示羊常乳的分離出的各組分多肽的峰。通過多次實驗后結(jié)果比較后，選擇254 nm作為最佳檢測波長，即在254 nm處各樣品中分離出的多肽種類最多，下同。

圖1 牛、羊常乳經(jīng)模擬消化后的多肽分離純化比較

由圖1(a)可以看出，牛乳中分離出來了3種不同的多肽組分，并且隨著進樣體積的增加，產(chǎn)生了一個最高吸收峰3，依據(jù)分子篩的原理，我們可以推斷多肽組分3的分子量小于多肽組分1和2。從圖1(b)可以看出，羊乳中分離出來了4種不同的多肽組分。說明羊乳中的多肽組分比牛乳中的多。眾所周知，羊乳的蛋白分子量低于牛乳的，所以羊乳蛋白更易水解產(chǎn)生多肽，這與Clarks[9]等人的研究相符合。

雖然AKTA PurifierTM10蛋白質(zhì)層析儀可以方便快速的區(qū)分樣品中的多肽組分種類，但其也只是初步的分離純化，如果需要更精確的區(qū)分，可能還需要更高級更好的儀器設(shè)備和方法，如Jasmin[10]等人研究的固相金屬親和色譜IMAC聯(lián)合質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法,反向或離子交換色譜結(jié)合等[11]。本研究著重初步區(qū)分牛、羊初乳經(jīng)過模擬人體消化后的多肽組分，并作比較，最后選出具有較好功能的可能是復(fù)雜成分的組分之后再做細分。

2.2 牛、羊初乳經(jīng)模擬消化后的多肽分離純化比較

初乳作為雌性動物剛產(chǎn)過子之后的乳，其營養(yǎng)是極為豐富的，尤其是蛋白質(zhì)，如免疫球蛋白等能夠抵抗很多疾病[12]。與常乳相比較，初乳中富含多種功能特性和生物活性的蛋白質(zhì)，主要包括β-乳球蛋白β-Lg)、α-乳白蛋白(α-La)、多肽、乳清白蛋白(SA)、免疫球蛋白(Ig)和乳鐵蛋白(Lf)。β-Lg和α-La含人體所需的幾乎全部氨基酸[13]，所以有必要對牛、羊初乳中的多肽組分進行分離純化，以探究對人體有積極作用的氨基酸序列。而已有研究者表明羊乳中的氨基酸種類多于牛乳并且人體所需的必須氨基酸質(zhì)量分數(shù)也較高[14]。

圖2描述了第1天牛、羊初乳經(jīng)過模擬消化后所分離出來的多肽組分。由圖2(a)知，第1天的牛初乳經(jīng)消化后分離出了2種多肽組分，而由圖2(b)知，第1天的羊初乳經(jīng)消化后分離出了3種多肽組分；圖3顯示了牛、羊初乳第1至7天分離出的組分比較，第1至第7天的牛初乳經(jīng)過消化后所分離出來的多肽組分沒有顯著變化，而在第7天，牛初乳中所分出的多肽組分最多有5種。從圖3知，第1至第7天羊初乳經(jīng)過消化后所分離出來的多肽組分有顯著的變化，從第1天至第3天，羊初乳所分離出的多肽組分逐漸增多，然后從第4天至第6天又減少了，第7天又增多；第3和第4天中分離出的多肽組分最多。

圖2 牛、羊初乳第1天經(jīng)模擬消化后的多肽分離純化比較

從圖3結(jié)果可以初步看出，羊初乳中所分離出的多肽明顯多于牛初乳中的，這與牛、羊初乳中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)構(gòu)和大小都有關(guān)[15]。

從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，牛、羊初乳第1天第2天的多肽組分均少于后面幾天，這可能與擠乳的衛(wèi)生環(huán)境，擠乳方法，擠乳設(shè)備有關(guān)[16]，有可能在開始的第一第二天，有害病原微生物會通過這些途徑傳播進入到初乳中去，這些有害病原微生物如結(jié)核分枝桿菌，沙門氏菌，李斯特菌和大腸桿菌等，或者是有一些病毒引發(fā)的炎癥[17]。因此第一第二天的初乳我們并不建議將其制成乳制品銷售。在模擬人體消化的時候，是一個pH值為2.0的酸性環(huán)境，會造成一些大分子蛋白的變性，而前兩天的初乳中含有大量大分子蛋白，所以減少了酶解的蛋白量也會導(dǎo)致肽組分的減少。到了第三天以后，蛋白大部分也趨于穩(wěn)定狀態(tài)，有些大分子蛋白分解成了小分子，所以酶解后會增加多肽的組分。近年來，鮮有人將牛羊初乳進行模擬消化后比較多肽組分，而本研究的目的就是要探究在人體吃進初乳之后，經(jīng)過消化后還有哪些多肽組分真正可能作用于人體健康。

圖3 牛、羊初乳第1至7天分離出的多肽組分比較

2.3 小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA結(jié)果即抗炎功能性分析

圖4 為ELISA試劑盒的標準曲線，應(yīng)用ELISAcalc軟件，用標準濃度和OD值計算出來了標準曲線方程為y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D,A=0.79643,B=1.19957,C=16.70256,D=0.01166,r2=0.99802。然后通過ELISA試劑盒檢測得到了所分離出來的59種多肽組分的OD值，最后計算出來了每種多肽組分中所含有的TNF-α的濃度值，從而確定該組分是否具有抗炎作用。

圖4 ELISA標準曲線

競爭性ELISA分析是一種有效的對樣品中抗原定量的免疫分析系統(tǒng)[18]。小鼠腫瘤壞死因子TNF-α已經(jīng)被確立為是一種與炎癥相關(guān)的細胞因子，并且在炎癥疾病中均可發(fā)現(xiàn)，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，回腸炎，細胞壁硬化或葡萄膜炎等。很多治療炎癥的策略集中在了降低TNF-α[7]。具有抗炎作用的多肽可以與由LPS脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α相互作用從而降低其對人體的傷害。本研究通過檢測分離出的59種多肽組分中的TNF-α濃度，可以確定哪些多肽組分對人體具有抗炎作用。

表1顯示了59種多肽組分中的TNF-α的濃度值，陽性對照值為18.52±0.027 ng/L，即LPS達到最大值且沒有樣品作用；陰性對照值為2.05±0.015 ng/L，即沒有LPS作用。從表中可以看出，所有乳樣品中小鼠腫瘤壞死因子TNF-α的濃度范圍是2.42±0.006 ng/L～18.03±0.102 ng/L，與陽性對照18.52±0.027 ng/L相比，所有分離出的多肽組分均降低了TNF-α的濃度，表明其均具有抗炎作用，只是作用的程度有所不同，通過比較發(fā)現(xiàn)，羊初乳第3天第1種多肽組分和第7天第1種多肽組分，牛初乳第3天第1種多肽組分和第7天第1種多肽組分均顯著的降低了TNF-α的濃度，所以其抗炎性能優(yōu)于其他組分，并且羊初乳降低TNF-α的濃度的幅度大，顯示出較好的抗炎性能；綜上，羊初乳第3天中含有的一種多肽中的TNF-α的濃度最低，所以其相比較其他組分顯示出最好的抗炎性能。

表1 每種肽組分中的TNF-α的濃度值(n=3)

3 結(jié) 論

⑴從牛初乳中分離出了23種多肽，從羊初乳中分離出了36種多肽，羊初乳中的多肽種類多于牛初乳。

⑵通過檢測，所有乳樣品中小鼠腫瘤壞死因子TNF-α的濃度范圍是(2.42±0.006)～(18.03±0.102) ng/L，與陽性對照(18.52±0.027)ng/L相比，所有分離出的多肽均具有抗炎作用。

⑶通過比較，羊初乳第3天中含有的一種多肽顯示出最好的抗炎性能，羊初乳的抗炎性能優(yōu)于牛初乳。

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