片球菌素BM-1免疫蛋白對甘露糖磷酸轉移酶受體識別特異性研究

周萬里，張京聲，張世湘，郝彥玲

(中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083)

0 引 言

乳酸菌細菌素的抑菌范圍不局限于近緣菌，也可殺死和抑制食品中的一些腐敗菌和病原菌[1]。細菌素進入人體后能夠被消化道內各種蛋白酶消化，低毒、無副作用。IIa類細菌素對單增李斯特氏菌具有強的抑制作用，因此對IIa類細菌素抑菌機制的研究成為熱點[2-3]。

甘露糖磷酸轉移酶系統(tǒng)IICD組分是IIa類細菌素的受體，細菌素結合受體，破壞細胞膜完整性，導致細胞死亡[4-6]。細菌素的同源免疫蛋白與受體-細菌素復合物的相互作用阻止細菌素對細胞的致死作用[6-8]。然而，免疫蛋白與受體結合的具體機制尚未闡述清楚。本研究在乳酸乳球菌中分別表達植物乳桿菌來源的mptIICD、腸膜明串珠菌來源的ptlIICD與免疫蛋白pedB，抑菌實驗結果表明免疫蛋白在與受體結合中存在特異性識別。

1 實 驗

1.1 材料

(1)菌株和質粒。產細菌素菌株植物乳桿菌BM-1分離自產于福建省的發(fā)酵魚制品，對細菌素敏感的植物乳桿菌WQ0815和腸膜明串珠菌05-43、乳酸乳球菌NZ9000及質粒pNZ8148由本實驗室保存。質粒pNZ8148的遺傳圖譜如圖1所示。

圖1 質粒pNZ8148的遺傳圖譜

(2)培養(yǎng)基和試劑。植物乳桿菌和腸膜明串珠菌培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基，乳酸乳球菌培養(yǎng)采用GM17培養(yǎng)基。限制性內切酶、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶和DNA Marker；質粒提取試劑盒；其他常規(guī)化學試劑均為國產分析純。

(3)引物合成。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及用途如表1所示。

表1 引物序列及用途

1.2 方法

1.2.1 對片球菌素BM-1敏感菌株的篩選

細菌素制備：活化后的植物乳桿菌BM-1發(fā)酵液以1%的接種量接種于1L MRS的液體培養(yǎng)中，37℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心15 min，收集上清液。將發(fā)酵上清液調至pH值為6.0，置于磁力攪拌器上，緩慢加入硫酸銨至最佳質量分數(shù)70%。4℃放置2 h后6 000r/min離心15 min，棄上清，將沉淀重懸于濃度為0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液中，離心除去殘留的不溶物，0.22 μm濾膜除菌得到細菌素溶液。

抑菌實驗采用牛津杯法[9]：以實驗室保存20株乳酸菌為目標菌株，利用牛津杯法篩選對細菌素敏感的乳酸菌。

1.2.2 載體pNZmptIICD和pNZptlIICD的構建

對于乳酸菌表達載體pNZmptIICD構建，首先以植物乳桿菌WQ0815基因組為模板，利用引物mptⅡCD-F和mptⅡCD-R擴增甘露糖磷酸轉移酶系統(tǒng)酶ⅡCD組分的編碼基因mptⅡCD，采用NcoI和XhoI分別雙酶切PCR產物和載體pNZ8148，將酶切后的PCR產物和載體在T4-DNA連接酶的作用下進行連接。連接產物電轉化入乳酸乳球菌NZ9000，將其涂布于含氯霉素(5 μg/mL)的MRS平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。 將得到的攜帶mptⅡCD基因的重組質粒命名為pNZmptIICD。對于乳酸菌表達載體pNZptlⅡCD的構建，載體構建策略與pNZmptⅡCD相同。首先以腸膜明串珠菌05-43的基因組為模板，利用引物ptlⅡCD-F和ptlⅡCD-R擴增甘露糖磷酸轉移酶系統(tǒng)酶IICD組分的編碼基因ptlⅡCD，將其構建到載體pNZ8148，將得到的攜帶ptlIICD基因的重組質粒命名為pNZptlIICD。

1.2.3 載體pNZmptB和pNZptlB的構建

以植物乳桿菌BM-1的基因組為模板，利用引物pedB-F和pedB-R擴增免疫蛋白編碼基因pedB，利用XhoI和XbaI雙酶切pedB的PCR產物，在T4-DNA連接酶的作用下分別與經XhoI和XbaI雙酶切回收的載體pNZmptIICD和pNZptlIICD進行連接，將得到的攜帶mptIICD和pedB基因的重組質粒命名為pNZmptB，攜帶ptlIICD和pedB基因的重組質粒命名為pNZptlB。

1.2.4 重組菌株對片球菌素BM-1的敏感性檢測

采用牛津杯法，以各重組菌株 (攜帶空載質粒pNZ8148的乳酸乳球菌(NZ9101)、攜帶質粒pNZmptIICD的乳酸乳球菌(NZ9104)、攜帶質粒pNZptlIICD的乳酸乳球菌(NZ9113)、攜帶質粒pNZmptB的乳酸乳球菌 (NZ9106)及攜帶質粒pNZptlB的乳酸乳球菌(NZ9114))為指示菌，檢測這些菌株對片球菌素的敏感性。

2 結果與分析

2.1 對片球菌素BM-1敏感的乳酸菌篩選

以實驗室保存的20株乳酸菌為出發(fā)菌株，利用牛津杯法篩選對片球菌素敏感的乳酸菌。實驗結果表明植物乳桿菌WQ0815和腸膜明串珠菌05-43對片球菌素BM-1敏感(圖2)。

圖2 WQ0815和05-43的敏感性分析

2.2 載體pNZmptIICD和pNZptlIICD的構建

以植物乳桿菌WQ0815基因組為模板擴增mptIICD基因，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條約1.8kb的條帶，與預期大小相符。將NcoI和XhoI雙酶切回收的mptIICD基因和pNZ8148載體進行連接，重組質粒pNZmptIICD經PCR鑒定獲得預期大小1.8kb的目的片段，經NCBI/Blast比對確定目的片段與植物乳桿菌ST-III中IICD的同源性達99%。證明攜帶mptIICD基因的乳酸菌表達載體構建成功(圖3)。同時以相同的方法獲得攜帶ptlIICD基因的乳酸菌表達載體pNZptlIICD(圖4)。

圖3 重組質粒pNZmptIICD的PCR鑒定

圖4 重現(xiàn)質粒pNZptlIICD的PCR鑒定

2.3 載體pNZmptB和pNZptlB的構建

以植物乳桿菌BM-1基因組為模板進行PCR擴增pedB基因，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條約300 bp的擴增條帶，與預期大小相符。將XhoI和XbaI雙酶切回收的pedB基因分別和經XhoI和XbaI雙酶切回收的pNZmptIICD、pNZptlIICD載體進行連接。重組質粒pNZmptB和pNZptlB經PCR鑒定獲得預期大小300bp的目的片段，經DNAMAN比對確定目的片段與植物乳桿菌BM-1中片球菌素BM-1同源免疫蛋白的同源性達100%。證明攜帶pedB基因的乳酸菌表達載體構建成功(圖5)。

圖5 重組質粒pNZmptB和pNZptlB的PCR鑒定

2.4 免疫蛋白與受體相互作用的驗證

首先對兩種不同來源的受體在宿主乳酸乳球菌中的有效性進行驗證。由圖6可知攜帶空載質粒pNZ8148的乳酸乳球菌(NZ9101)對片球菌素BM-1不敏感，而攜帶質粒pNZmptIICD和pNZptlIICD的乳酸乳球菌 (NZ9104和NZ9113)對片球菌素BM-1敏感，實驗結果表明植物乳桿菌中WQ0815的mptIICD和腸膜名串珠菌05-43的ptlIICD在NZ9000中表達可作為片球菌素BM-1的受體，使得對片球菌素BM-1不敏感的NZ9000對片球菌素BM-1敏感。

由圖6同時可知攜帶重組質粒pNZmptB的乳酸乳球菌(NZ9106)對片球菌素BM-1不敏感，而攜帶重組質粒pNZptlB的乳酸乳球菌 (NZ9114)對片球菌素BM-1敏感。結果說明：免疫蛋白在NZ9000中表達后可識別植物乳桿菌的甘露糖磷酸轉移酶IICD組分mptIICD，同時結合片球菌素BM-1，三者結合形成免疫蛋白-受體-細菌素復合物，阻止細菌素的抑菌作用，導致宿主菌對片球菌素BM-1產生抗性；而免疫蛋白不識別腸膜明串珠菌的甘露糖磷酸轉移酶IICD組分ptlIICD，從而導致宿主菌對片球菌素BM-1敏感。

圖6 重組菌株的敏感性分析

3 結 論

目前，對IIa類細菌素抑菌機制的研究主要集中在細菌素、受體及免疫蛋白三者的相互作用。IIa類細菌素N端β折疊區(qū)域特異性識別位于甘露糖磷酸轉移酶系統(tǒng)IIC組分N端的胞外環(huán)，兩者結合形成的復合物導致細胞膜出現(xiàn)致死孔洞[10，11]。在產細菌素菌株胞內，免疫蛋白通過識別細菌素-受體復合物阻止細菌素的抑菌作用，而免疫蛋白與細菌素的識別作用表現(xiàn)出高度的特異性[8,12,13]。本文重點研究免疫蛋白和受體的特異性識別情況，首先分別在乳酸乳球菌NZ9000中誘導表達兩種不同來源的甘露糖磷酸轉移酶系統(tǒng)IICD組分，抑菌實驗結果表明這兩種受體可識別結合片球菌素BM-1。進一步在乳酸乳球菌NZ9000中誘導表達植物乳桿菌WQ0815來源的IICD組分mptIICD和免疫蛋白pedB，抑菌實驗結果表明：免疫蛋白pedB可識別片球菌素BM-1與mptIICD組分，形成復合物免疫蛋白-片球菌素-mptIICD，阻止片球菌素BM-1的抑菌作用。在乳酸乳球菌中誘導表達腸膜明串珠菌05-43來源的IICD組分ptlIICD和免疫蛋白pedB，抑菌實驗結果表明：免疫蛋白不能識別ptlIICD組分，導致復合物片球菌素-ptlIICD殺死細胞。研究結果證明了免疫蛋白對受體存在特異性識別，為免疫蛋白與受體作用的進一步研究奠定了基礎。

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