氧氟沙星噬菌體庫(kù)的構(gòu)建、篩選及抗體結(jié)構(gòu)模擬

張秀媛等

摘 要 應(yīng)用噬菌體展示和重組抗體技術(shù)制備抗氧氟沙星單鏈抗體（scFv）庫(kù)，篩選獲得氧氟沙星特異性噬菌體scFv以及同源模擬其三維結(jié)構(gòu)。將從氧氟沙星雜交瘤細(xì)胞提取的總RNA，用RTPCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 以針對(duì)鼠源重鏈可變區(qū)（VH）及輕鏈可變區(qū)（VL）基因的兼并引物， 擴(kuò)增獲得VH和VL可變區(qū)基因，通過(guò)SOEPCR法將VH基因和VL基因通過(guò)柔性多肽Linker

關(guān)鍵詞 氧氟沙星； 單鏈抗體； 噬菌體展示； 酶聯(lián)免疫分析

1 引 言

氧氟沙星（Ofloxacin）為第三代喹諾酮類抗菌藥，抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌均有強(qiáng)大的抗菌作用，對(duì)厭氧菌和肺炎支原體也有良好作用，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。喹諾酮類藥物對(duì)人體有一定副作用，包括對(duì)胃腸道不良反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)、心臟的毒性作用[1]，在牲畜體內(nèi)的殘留毒性會(huì)對(duì)環(huán)境及人體健康造成嚴(yán)重危害。

單鏈抗體作為第三代抗體，應(yīng)用DNA重組技術(shù)及蛋白質(zhì)工程技術(shù)將抗體基因進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后克隆到合適的表達(dá)載體中，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)并正確折疊成具有生物學(xué)功能的一種抗體分子。由于其具有分子小、免疫原性低、可塑性強(qiáng)及不需免疫動(dòng)物可大批生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)環(huán)境和食品中抗菌素殘留方面顯示出前兩代抗體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)[2]。

目前，還沒(méi)有關(guān)于氧氟沙星噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建的相關(guān)報(bào)道。本研究利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)， 構(gòu)建抗氧氟沙星噬菌體單鏈抗體庫(kù)， 從中篩選出具有抗原結(jié)合活性的抗氧氟沙星單鏈抗體噬菌體陽(yáng)性克隆， 并獲得抗氧氟沙星特異性單鏈抗體的基因序列， 為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)氧氟沙星免疫法快速檢測(cè)提供一種獲得抗氧氟沙星特異性抗體的新途徑。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

氧氟沙星雜交瘤細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室制備；

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用T7噬菌體構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)。References

1 DONG JinHe， DONG Feng， ZHAO XianRong. Chinese Journal of Drug Abuse Prevention and Treatment， 2002， 41（6）： 13-14

董進(jìn)和， 董 峰， 趙憲榮. 中國(guó)藥物濫用防治雜志， 2002， 41（6）： 13-14

2 PAN Ke， WANG Hong， ZHANG HongBin， SUN MingYuan. Journal of South China University of Technology， 2005， 11（33）： 51-54

潘 科， 王 弘， 張宏斌， 孫明遠(yuǎn). 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 11（33）： 51-54

3 Imai S， Mukai Y， Nagano K. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 2006， 29（21）： 1325-1330

4 MIAO XiangYang， DING ShuYan. Scientia Agricultura Sinica， 2005， 38（6）： 1260-1263

苗向陽(yáng)， 丁淑燕. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005， 38（6）： 1260-1263

5 Poul M A， Becerril B， Nielsen U B. J Microbiol Methods， 2000， 301（5）： 1149-1161

6 Levinson H J S， Mudget tHunter M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1988， 85（20）： 5879-5883

7 Li T J， Zhang Q， Liu Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（21）： 9085-9091

8 Abigail V J C， Adam P B， Andrew C R M. Journal of Molecular Biology， 2003， 325（45）： 337-354

9 Brichta J， Hnilova M， Viskovic T. Veterinarni Medicina， 2005， 50（6）： 231-252

Construction， Screening and Antibody Structure Homology

Modeling of Phage Single Chain Variable Fragment

Library Against Ofloxacin

ZHANG XiuYuan1， HE Kuo*1，2， DU XinJun2， WANG JunPing2， YANG Qing2

1（Heibei North University， Zhangjiakou 075000， China）

2（Tianjin University of Science and Technology，

Ministry of Education Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety， Tianjin 300457， China）

Abstract To construct a library of mouse single chain variable fragment （scFv） antibody against ofloxacin using phage display and recombinant antibody technique， specific antiofloxacin scFv was screened and 3D structure was homology modeling. Total RNA was extracted from hybridoma cell of ofloxacin mAb， and was used to amplify VH and VL gene by RTPCR using random primer. Then they were linked by a DNA linker encoding （G1y4Ser）3 as VHlinkerVL sequence forming scFv by SOE（splicing by overlap extension） PCR. These fragments were inserted into phage T7 after double digestion and transformed with host bacteria BLT5403.3×105 pfu/ml single chain antibody phage libraries were successfully constructed. Four positive phage scFv clones were screened by direct competitive ELISA after four times of enriched procedure in the order of adsorptionelutionamplificatio， 3D structure of specific scFv was homology modeling finally. This research lays a foundation for further massive expression of antiofloxacin scFv.

Keywords Ofloxacin； Single chain antibody phage libraries； Phage display； Enzymelinked immumoadsorbent assay（Received 17 October 2013； Accepted 24 March 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.20905058）

摘 要 應(yīng)用噬菌體展示和重組抗體技術(shù)制備抗氧氟沙星單鏈抗體（scFv）庫(kù)，篩選獲得氧氟沙星特異性噬菌體scFv以及同源模擬其三維結(jié)構(gòu)。將從氧氟沙星雜交瘤細(xì)胞提取的總RNA，用RTPCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 以針對(duì)鼠源重鏈可變區(qū)（VH）及輕鏈可變區(qū)（VL）基因的兼并引物， 擴(kuò)增獲得VH和VL可變區(qū)基因，通過(guò)SOEPCR法將VH基因和VL基因通過(guò)柔性多肽Linker

關(guān)鍵詞 氧氟沙星； 單鏈抗體； 噬菌體展示； 酶聯(lián)免疫分析

1 引 言

氧氟沙星（Ofloxacin）為第三代喹諾酮類抗菌藥，抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌均有強(qiáng)大的抗菌作用，對(duì)厭氧菌和肺炎支原體也有良好作用，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。喹諾酮類藥物對(duì)人體有一定副作用，包括對(duì)胃腸道不良反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)、心臟的毒性作用[1]，在牲畜體內(nèi)的殘留毒性會(huì)對(duì)環(huán)境及人體健康造成嚴(yán)重危害。

單鏈抗體作為第三代抗體，應(yīng)用DNA重組技術(shù)及蛋白質(zhì)工程技術(shù)將抗體基因進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后克隆到合適的表達(dá)載體中，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)并正確折疊成具有生物學(xué)功能的一種抗體分子。由于其具有分子小、免疫原性低、可塑性強(qiáng)及不需免疫動(dòng)物可大批生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)環(huán)境和食品中抗菌素殘留方面顯示出前兩代抗體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)[2]。

目前，還沒(méi)有關(guān)于氧氟沙星噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建的相關(guān)報(bào)道。本研究利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)， 構(gòu)建抗氧氟沙星噬菌體單鏈抗體庫(kù)， 從中篩選出具有抗原結(jié)合活性的抗氧氟沙星單鏈抗體噬菌體陽(yáng)性克隆， 并獲得抗氧氟沙星特異性單鏈抗體的基因序列， 為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)氧氟沙星免疫法快速檢測(cè)提供一種獲得抗氧氟沙星特異性抗體的新途徑。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

氧氟沙星雜交瘤細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室制備；

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用T7噬菌體構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)。References

1 DONG JinHe， DONG Feng， ZHAO XianRong. Chinese Journal of Drug Abuse Prevention and Treatment， 2002， 41（6）： 13-14

董進(jìn)和， 董 峰， 趙憲榮. 中國(guó)藥物濫用防治雜志， 2002， 41（6）： 13-14

2 PAN Ke， WANG Hong， ZHANG HongBin， SUN MingYuan. Journal of South China University of Technology， 2005， 11（33）： 51-54

潘 科， 王 弘， 張宏斌， 孫明遠(yuǎn). 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 11（33）： 51-54

3 Imai S， Mukai Y， Nagano K. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 2006， 29（21）： 1325-1330

4 MIAO XiangYang， DING ShuYan. Scientia Agricultura Sinica， 2005， 38（6）： 1260-1263

苗向陽(yáng)， 丁淑燕. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005， 38（6）： 1260-1263

5 Poul M A， Becerril B， Nielsen U B. J Microbiol Methods， 2000， 301（5）： 1149-1161

6 Levinson H J S， Mudget tHunter M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1988， 85（20）： 5879-5883

7 Li T J， Zhang Q， Liu Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（21）： 9085-9091

8 Abigail V J C， Adam P B， Andrew C R M. Journal of Molecular Biology， 2003， 325（45）： 337-354

9 Brichta J， Hnilova M， Viskovic T. Veterinarni Medicina， 2005， 50（6）： 231-252

Construction， Screening and Antibody Structure Homology

Modeling of Phage Single Chain Variable Fragment

Library Against Ofloxacin

ZHANG XiuYuan1， HE Kuo*1，2， DU XinJun2， WANG JunPing2， YANG Qing2

1（Heibei North University， Zhangjiakou 075000， China）

2（Tianjin University of Science and Technology，

Ministry of Education Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety， Tianjin 300457， China）

Abstract To construct a library of mouse single chain variable fragment （scFv） antibody against ofloxacin using phage display and recombinant antibody technique， specific antiofloxacin scFv was screened and 3D structure was homology modeling. Total RNA was extracted from hybridoma cell of ofloxacin mAb， and was used to amplify VH and VL gene by RTPCR using random primer. Then they were linked by a DNA linker encoding （G1y4Ser）3 as VHlinkerVL sequence forming scFv by SOE（splicing by overlap extension） PCR. These fragments were inserted into phage T7 after double digestion and transformed with host bacteria BLT5403.3×105 pfu/ml single chain antibody phage libraries were successfully constructed. Four positive phage scFv clones were screened by direct competitive ELISA after four times of enriched procedure in the order of adsorptionelutionamplificatio， 3D structure of specific scFv was homology modeling finally. This research lays a foundation for further massive expression of antiofloxacin scFv.

Keywords Ofloxacin； Single chain antibody phage libraries； Phage display； Enzymelinked immumoadsorbent assay（Received 17 October 2013； Accepted 24 March 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.20905058）

摘 要 應(yīng)用噬菌體展示和重組抗體技術(shù)制備抗氧氟沙星單鏈抗體（scFv）庫(kù)，篩選獲得氧氟沙星特異性噬菌體scFv以及同源模擬其三維結(jié)構(gòu)。將從氧氟沙星雜交瘤細(xì)胞提取的總RNA，用RTPCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 以針對(duì)鼠源重鏈可變區(qū)（VH）及輕鏈可變區(qū)（VL）基因的兼并引物， 擴(kuò)增獲得VH和VL可變區(qū)基因，通過(guò)SOEPCR法將VH基因和VL基因通過(guò)柔性多肽Linker

關(guān)鍵詞 氧氟沙星； 單鏈抗體； 噬菌體展示； 酶聯(lián)免疫分析

1 引 言

氧氟沙星（Ofloxacin）為第三代喹諾酮類抗菌藥，抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌均有強(qiáng)大的抗菌作用，對(duì)厭氧菌和肺炎支原體也有良好作用，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。喹諾酮類藥物對(duì)人體有一定副作用，包括對(duì)胃腸道不良反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)、心臟的毒性作用[1]，在牲畜體內(nèi)的殘留毒性會(huì)對(duì)環(huán)境及人體健康造成嚴(yán)重危害。

單鏈抗體作為第三代抗體，應(yīng)用DNA重組技術(shù)及蛋白質(zhì)工程技術(shù)將抗體基因進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后克隆到合適的表達(dá)載體中，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)并正確折疊成具有生物學(xué)功能的一種抗體分子。由于其具有分子小、免疫原性低、可塑性強(qiáng)及不需免疫動(dòng)物可大批生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)環(huán)境和食品中抗菌素殘留方面顯示出前兩代抗體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)[2]。

目前，還沒(méi)有關(guān)于氧氟沙星噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建的相關(guān)報(bào)道。本研究利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)， 構(gòu)建抗氧氟沙星噬菌體單鏈抗體庫(kù)， 從中篩選出具有抗原結(jié)合活性的抗氧氟沙星單鏈抗體噬菌體陽(yáng)性克隆， 并獲得抗氧氟沙星特異性單鏈抗體的基因序列， 為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)氧氟沙星免疫法快速檢測(cè)提供一種獲得抗氧氟沙星特異性抗體的新途徑。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

氧氟沙星雜交瘤細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室制備；

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用T7噬菌體構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)。References

1 DONG JinHe， DONG Feng， ZHAO XianRong. Chinese Journal of Drug Abuse Prevention and Treatment， 2002， 41（6）： 13-14

董進(jìn)和， 董 峰， 趙憲榮. 中國(guó)藥物濫用防治雜志， 2002， 41（6）： 13-14

2 PAN Ke， WANG Hong， ZHANG HongBin， SUN MingYuan. Journal of South China University of Technology， 2005， 11（33）： 51-54

潘 科， 王 弘， 張宏斌， 孫明遠(yuǎn). 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 11（33）： 51-54

3 Imai S， Mukai Y， Nagano K. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 2006， 29（21）： 1325-1330

4 MIAO XiangYang， DING ShuYan. Scientia Agricultura Sinica， 2005， 38（6）： 1260-1263

苗向陽(yáng)， 丁淑燕. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005， 38（6）： 1260-1263

5 Poul M A， Becerril B， Nielsen U B. J Microbiol Methods， 2000， 301（5）： 1149-1161

6 Levinson H J S， Mudget tHunter M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1988， 85（20）： 5879-5883

7 Li T J， Zhang Q， Liu Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（21）： 9085-9091

8 Abigail V J C， Adam P B， Andrew C R M. Journal of Molecular Biology， 2003， 325（45）： 337-354

9 Brichta J， Hnilova M， Viskovic T. Veterinarni Medicina， 2005， 50（6）： 231-252

Construction， Screening and Antibody Structure Homology

Modeling of Phage Single Chain Variable Fragment

Library Against Ofloxacin

ZHANG XiuYuan1， HE Kuo*1，2， DU XinJun2， WANG JunPing2， YANG Qing2

1（Heibei North University， Zhangjiakou 075000， China）

2（Tianjin University of Science and Technology，

Ministry of Education Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety， Tianjin 300457， China）

Abstract To construct a library of mouse single chain variable fragment （scFv） antibody against ofloxacin using phage display and recombinant antibody technique， specific antiofloxacin scFv was screened and 3D structure was homology modeling. Total RNA was extracted from hybridoma cell of ofloxacin mAb， and was used to amplify VH and VL gene by RTPCR using random primer. Then they were linked by a DNA linker encoding （G1y4Ser）3 as VHlinkerVL sequence forming scFv by SOE（splicing by overlap extension） PCR. These fragments were inserted into phage T7 after double digestion and transformed with host bacteria BLT5403.3×105 pfu/ml single chain antibody phage libraries were successfully constructed. Four positive phage scFv clones were screened by direct competitive ELISA after four times of enriched procedure in the order of adsorptionelutionamplificatio， 3D structure of specific scFv was homology modeling finally. This research lays a foundation for further massive expression of antiofloxacin scFv.

Keywords Ofloxacin； Single chain antibody phage libraries； Phage display； Enzymelinked immumoadsorbent assay（Received 17 October 2013； Accepted 24 March 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.20905058）