Dicer在RNA沉默中的作用

何明洋

摘 要：RNA沉默是一種在真核生物中廣泛存在的防御機(jī)制，它的一個(gè)主要作用是抗病毒。為了闡明這個(gè)機(jī)制，很多植物病毒的功能蛋白都被用來(lái)做RNA沉默抑制子的研究。RNA III聚合酶家族的Dicer在基因沉默機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，不同的物種含有不同數(shù)量和種類的Dicer，可以將外源的mRNA切割成21-26nt的小片段，從而阻斷外源基因的翻譯途徑，達(dá)到基因沉默的目的。病原物在進(jìn)化的過(guò)程中，編碼沉默抑制子蛋白，對(duì)抗寄主的基因沉默。沉默抑制子通過(guò)與寄主的蛋白或外源RNA等互作，抑制寄主的基因沉默。關(guān)于Dicer與沉默抑制子的研究將給更好地解析基因沉默機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：RNA沉默；沉默抑制子；Dicer

植物和無(wú)脊椎動(dòng)物能夠利用基因沉默機(jī)制可以保護(hù)他們免受病毒的攻擊，RNA沉默在植物中被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在真菌體內(nèi)被稱為基因壓制，在動(dòng)物體內(nèi)被稱為RNA干涉[1]。

Dicer，是RNaseIII核酸內(nèi)切酶超家族成員，其在RNA沉默過(guò)程中起著重要的作用，它在RNAi和miRNA形成的路徑中是一種關(guān)鍵的酶，RNAi和miRNA的產(chǎn)生過(guò)程中是需要dicer or dicer-like，同時(shí)它也在RNA沉默的效應(yīng)階段起著重要的作用，能夠和RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體結(jié)合[2]。在RNA沉默的機(jī)制中，Dicer能夠長(zhǎng)的雙鏈RNA剪切為短小的、寡核苷酸數(shù)量在21-24個(gè)堿基siRNA。緊接著這些siRNA被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，使復(fù)合體活化，然后與靶標(biāo)mRNA結(jié)合并降解它?；蚪M序列測(cè)定表明真核基因組中的dcl蛋白數(shù)量從人類的一種dicer到模式生物擬南芥中的四種dicer不等。哺乳動(dòng)物僅僅只有一個(gè)dcl蛋白，但它確參與了兩個(gè)不同途徑的RNA沉默過(guò)成：siRNA和miRNA；相反，在其他生物種發(fā)現(xiàn)了較復(fù)雜的dcl蛋白比如果蠅、擬南芥和真菌。這些dcl蛋白被指出是在RNA沉默過(guò)程中起著比較重要的作用。鑒于這些復(fù)雜的蛋白的功能特殊性，現(xiàn)在很多的學(xué)者很有興趣知道這些功能多樣性的dcl蛋白在進(jìn)化過(guò)程中是怎樣和不同的RNA沉默的路徑相關(guān)的。

植物比其他真核生物含有更多的DICER-LIKE （DCL） enzymes和雙鏈RNA結(jié)合蛋白，能夠增加小RNA的復(fù)雜性。在擬南芥中，已經(jīng)報(bào)道有四種基因編碼的蛋白屬于DCL家族成員（DCL1到DCL4），從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的結(jié)論可知dcl3蛋白沒(méi)有任何的雙鏈RNA結(jié)合基序區(qū)域但是它卻含有兩個(gè)和雙鏈RNA結(jié)合基序區(qū)域的序列，而dcl1已經(jīng)被報(bào)道與miRNA的產(chǎn)生有關(guān)，最近又有分析說(shuō)dcl2和dcl3和病毒的siRNA和寄主內(nèi)源siRNA的合成有關(guān)。通過(guò)分析單dcl突變體，雙dcl突變體，三dcl突變體和四dcl突變體的分析，只有dcl1作為一種復(fù)雜精細(xì)的酶能夠產(chǎn)生miRNA和siRNA，而其他的三種dcls僅僅只能產(chǎn)生siRNA。dcl2蛋白在一定的條件下能夠拮抗由dcl1蛋白產(chǎn)生的miRNA和siRNA的產(chǎn)生，在dcl1 dcl4和dcl1 dcl3 dcl4突變體中能夠使植物發(fā)病，然而突變體dcl1 dcl2 dcl3 dcl4植物中，不會(huì)是植物發(fā)病。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)病毒的siRNA是由dcl4蛋白產(chǎn)生的，但當(dāng)dcl4得活性降低時(shí)或者其活性被病毒抑制時(shí)，dcl2在一定條件下可以取代dcl4的功能。由于植物中小RNA組分的復(fù)雜性，每個(gè)dcl蛋白的具體功能（尤其是dcl2）還不是很清楚[3]。另外，能夠和特異的雙鏈RNA結(jié)合的蛋白是和細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)相關(guān)的，同時(shí)還具有保守的雙鏈RNA結(jié)合基序。

而在哺乳細(xì)胞中，例如脆性X綜合癥蛋白（FMRP）已經(jīng)被報(bào)道是miRNA的一部分，通過(guò)利用重組蛋白的方法，我們已經(jīng)證明人類的脆性X綜合癥蛋白可以當(dāng)做miRNA的受體蛋白對(duì)于核糖核酸酶Dicer來(lái)說(shuō)，同時(shí)能夠和靶標(biāo)RNA結(jié)合，使其降解。體內(nèi)有效的RNA干涉所需要的miRNA已經(jīng)被揭示了利用不同的siRNA誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的報(bào)告基因沉默的方法[4]。在真菌體內(nèi)，由于突變兩種dcls基因而使dcl蛋白的活性降低的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛳D(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的基因沉默和使雙鏈RNA變成siRNA的形成過(guò)程。第一個(gè)說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的基因沉默中起作用的dicer蛋白是在RNA依賴性的RNA聚合酶作用下形成的雙鏈RNA參與的沉默過(guò)程中是起著重要作用的。絲狀真菌基因組中有兩種DCL基因（dcl1和dcl2）應(yīng)經(jīng)被證實(shí)。已有報(bào)道說(shuō)如果存在dcl2突變體的情況下會(huì)破壞基因沉默從而使綠色熒光蛋白的強(qiáng)度增強(qiáng)，也能夠使siRNA的積累水平降低到無(wú)法檢測(cè)的水平[5]。但是，如果突變其他的DCL基因例如dcl1基因，它仍然會(huì)像野生型的一樣產(chǎn)生基因沉默也可以使siRNA積累到可以檢測(cè)的水平。報(bào)道還說(shuō)明當(dāng)在基因沉默不充分的表型真菌和由于dcl2基因突變無(wú)法積累siRNA的真菌體內(nèi)都可以通過(guò)野生型（即帶有dcl2基因）真菌來(lái)使其恢復(fù)正常表型。這說(shuō)明只有dcl2蛋白能夠促進(jìn)siRNA的形成。

而在卷枝毛霉菌中，RNA沉默能夠出現(xiàn)不尋常的特點(diǎn)，比如正義鏈的自我復(fù)制，兩種反義鏈siRNA的積累。研究學(xué)者為了調(diào)查這種基因沉默是不是遵循他物種基因沉默機(jī)制，他們使用發(fā)夾RNA作為基因沉默的觸發(fā)器來(lái)分析在不同的基因環(huán)境下基因沉默的有效性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默機(jī)制也和兩種反義的siRNA的積累有關(guān)的。但是這種基因沉默的機(jī)制并不和前人研究的由dcl1基因有關(guān)，而是和另外一種基因dcl2有關(guān)，dcl2基因首先被識(shí)別和克隆，同時(shí)相應(yīng)的無(wú)效突變體也由基因復(fù)制所產(chǎn)生。但是這種突變體在基因沉默中會(huì)被正義鏈自我復(fù)制或者反向重復(fù)基因所損傷，另外dcl2功能的行使也是需要兩種反義siRNA 的正常積累的。除了其在基因沉默中的重要作用，dcl2也在植物發(fā)展方面起著重要的作用，因?yàn)閐cl2的無(wú)效突變體能夠顯著減少無(wú)性孢子的產(chǎn)生。

植物和動(dòng)物病毒由于不斷地演化，能夠編碼產(chǎn)生各種RNA沉默的抑制子來(lái)抵抗寄主的抗病毒沉默，通過(guò)利用基因沉默檢測(cè)的方法能夠鑒別和描述沉默抑制子的活性，在接種的原生質(zhì)體中沉默抑制子能夠增強(qiáng)病毒的沉默，促進(jìn)病毒在植物葉片細(xì)胞之間的短距離運(yùn)動(dòng)和依賴于韌皮部的長(zhǎng)距離病毒運(yùn)動(dòng)，就能夠造成系統(tǒng)侵染的組織中造成病癥[6]。當(dāng)植物受到病毒侵染時(shí)，不同的沉默的抑制子是怎樣在沉默的不同階段發(fā)揮作用的；沉默抑制子在抑制沉默過(guò)程中是不是起直接作用而引起發(fā)病癥狀，是Ding等人討論的問(wèn)題。Ding等人在煙草和擬南芥中通過(guò)“交叉保護(hù)”[7]機(jī)制來(lái)抵抗CMV的侵染。首先，在擬南芥葉片上接種不含有抑制子2b的CMV，然后一段時(shí)間后，當(dāng)病毒CMV再次侵染時(shí)，擬南芥不會(huì)感病，無(wú)病害癥狀產(chǎn)生。CMV的突變體2b（CMV-△2b）引起的交叉保護(hù)不是基因沉默。我們想通過(guò)調(diào)查分析這種機(jī)制和基因沉默的發(fā)生過(guò)程是不是有關(guān)聯(lián)的，因?yàn)榛虺聊^(guò)程中能夠編碼四種DCL蛋白，其中的dcl2、dcl3和dcl4參與到抗病毒沉默的過(guò)程中。在野生型擬南芥植物中，侵染CMV-△2b是不會(huì)產(chǎn)生病癥的，受到交叉保護(hù)的機(jī)制，當(dāng)CMV-2b也侵染此擬南芥時(shí)，植株是不會(huì)感病的。CMV-△2b對(duì)抗CMV-2b所產(chǎn)生的交叉保護(hù)反應(yīng)也可以在dcl2、dcl3或者dcl4突變體中觀察到，而且在dcl2 dcl4雙突變體中其反應(yīng)更強(qiáng)烈。但是，當(dāng)侵染擬南芥的CMV-△2b含量很高時(shí)，也能夠使植株發(fā)病。這種結(jié)果說(shuō)明CMV-△2b與CMV-2b產(chǎn)生的交叉保護(hù)機(jī)制并不是完全依賴于基因沉默機(jī)制，也有可能和病毒之間的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)[8]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)在布氏錐蟲(chóng)體內(nèi)，基因沉默的一種保守途徑是RNA干涉，RNA干涉過(guò)程中涉及到兩種核糖核酸內(nèi)切酶：一個(gè)是Dicer蛋白，另外一種是AGO蛋白或者是Slicer蛋白[9]。其中DCL蛋白是RnaseⅢ家族成員，它能夠促使siRNA的產(chǎn)生，從而引起RNA干涉作用。研究還發(fā)現(xiàn)，Dicer和DCL蛋白在羧基端都有兩個(gè)臨近的區(qū)域蛋白分別稱為RNase IIIa和RNase IIIb，這兩種區(qū)域的出現(xiàn)在布氏錐蟲(chóng)DCL蛋白結(jié)構(gòu)中是不尋常的，RNase IIIa是接近氨基端，RNase IIIb卻被定位在酶分子的中心區(qū)域，基于這種結(jié)構(gòu)的特性使的dcl RNaseⅢ具有活性。

參考文獻(xiàn)

[1]Naoki Kadotani， Toshiki Murata， Nguyen Bao Quoc， Yusuke Adachi and Hitoshi Nakayashiki. Transcriptional Control and Protein Specialization Have Roles in the Functional Diversification of Two Dicer-Like Proteins in Magnaporthe oryzae. Genetics 180： 1245-1249 （October 2008）.

[2]Lukasz Jaskiewicz and Witold Filipowicz. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2008.

[3]Nicolas Bouche'， Dominique Lauressergues，Virginie Gasciolli and Herve' Vaucheret. An antagonistic function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs. The EMBO Journal （2006） 25：3347-3356.

[4]Isabelle Plante， Laetitia Davidovic， Dominique L. Ouellet， Lise-Andr？ee Gobeil， Sandra Tremblay， EdouardW. Khandjian， and Patrick Provost. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Volume 2006， Article ID 64347， DOI10.1155/JBB/2006/64347.

[5]Naoki Kadotani， Hitoshi Nakayashiki ， Yukio Tosa， and Shigeyuki Mayama. One of the Two Dicer-like Proteins in the Filamentous Fungi Magnaporthe oryzae Genome Is Responsible for Hairpin RNA-triggered RNA Silencing and Related Small Interfering RNA Accumulation. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 279， No. 43： 44467-44474，2004.

[6]Juan A. Diaz-Pendon， Feng Li，Wan-Xiang Li， and Shou-Wei Ding. Suppression of Antiviral Silencing by Cucumber Mosaic Virus 2b Protein in Arabidopsis Is Associated with Drastically Reduced Accumulation of Three Classes of Viral Small Interfering RNAs. The Plant Cell， Vol. 19： 2053-2063， June 2007.

[7]A. Gal-On and Y. M. Shiboleth. Cross-Protection . Natural Resistance Mechanisms of Plants to Viruses， 261-288.

[8]Heiko Ziebell and John P. Carr. Effects of dicer-like endoribonucleases 2 and 4 on infection of Arabidopsis thaliana by cucumber mosaic virus and a mutant virus lacking the 2b counter-defence protein gene. Journal of General Virology （2009）， 90： 2288-2292.

[9]Huafang Shi， Christian Tschudi and Elisabetta Ullu. An unusual Dicer-like1 protein fuels the RNA interference pathway in Trypanosoma brucei. RNA 2006 12： 2063-2072.