HPLC 法測(cè)定菊花七味膠囊中膽紅素的含量

王文忠 孫 瑛 何春龍 李樹明

(1.內(nèi)蒙古第三醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

菊花七味膠囊是《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》(1998 年版)收載品種，蒙藥名為烏達(dá)巴拉-7，由菊花、人工牛黃、五靈脂、石膏、紅花、麥冬、苦參7 味藥材組成，具有涼血清“協(xié)日”用于胃“協(xié)日”胃酸口苦食欲不振血熱頭痛［1］。人工牛黃是菊花七味膠囊的主要成分之一，具有清熱解毒，祛痰利咽的功能。而膽紅素是人工牛黃的主要化學(xué)成分。由于原標(biāo)準(zhǔn)中沒有收載相關(guān)定性定量指標(biāo)，故參考文獻(xiàn)［2-8］采用高效液相色譜法測(cè)定菊花七味膠囊中人工牛黃中的膽紅素含量，可為該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器: 島津LC -20A 高效液相色譜儀;色譜柱: 依利特C18 柱(5μm，4.6mm x250mm);KQ5200E 型超聲儀(功率200W，頻率40KHz);電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，0.0001g)。

1.2 試劑與藥品: 膽紅素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào): 100077 -200805，供含量測(cè)定用);菊花七味膠囊(呼和浩特中蒙醫(yī)院，批號(hào): 140217、140321;實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào): 130910;)甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件: 色譜柱: 依利特C18 柱(250mm ×4.6mm，5μm);流動(dòng)相: 甲醇-三氯甲烷-l%磷酸溶液(72: 25: 3);檢測(cè)波長(zhǎng): 450nm;流速: 1.0mL·min-1;柱溫: 25℃;理論板數(shù): 按膽紅素色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 溶液的制備: 對(duì)照品溶液的制備: 精密稱取膽紅素對(duì)照品5mg，置100mL 棕色容量瓶中，加三氯甲烷制成50μg﹒mL-1的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液20mL 置于100mL 棕色容量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，配制成10μg﹒mL-1對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備: 取菊花七味膠囊內(nèi)容物0.12g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入三氯甲烷-甲醇-鹽酸-水(400: 98: 0.3: 1. 7)混合溶液10mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，稱定重量，用上述溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液的制備: 按照處方稱取除人工牛黃外的其他藥材，按照制備供試品溶液的方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn): 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，膽紅素與其他組分色譜峰可基線分離，分離度符合規(guī)定，且陰性樣品無干擾。色譜圖見圖1。

2.4 線性范圍: 精密吸取膽紅素對(duì)照品儲(chǔ)備液(50μg ﹒mL-1)0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、6.0mL，分別置于10mL 棕色容量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度，搖勻，分別制成含膽紅素1、2、5、10、20、30μg ﹒ mL-1的溶液。按照“2.1”色譜條件，分別吸取10μL 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以濃度C(μg ﹒mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=39007C+5636.5，r =0.9993，結(jié)果顯示: 膽紅素在1.0μg ﹒ mL-1～30μg ﹒ mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn): 分別精密吸取供試品溶液(批號(hào): 130910)與對(duì)照品溶液(10μg ﹒ mL-1)各10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 針，分別測(cè)定峰面積，結(jié)果供試品溶液RSD 為1.38%;對(duì)照品溶液的RSD 為1.61%。結(jié)果表明: 該方法精密度良好，符合含量測(cè)定要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn): 取供試品(批號(hào): 130910)溶液，分別于0、2、4、6、8 及10h 進(jìn)樣，各進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，RSD 為1.41%。結(jié)果表明: 供試品溶液在10h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn): 取供試品(批號(hào): 130910)約0.12g，精密稱定6 份。分別按“2.2”方法制備供試品溶液，各精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀。測(cè)定峰面積，并計(jì)算含量，結(jié)果膽紅素平均含量為0.9062mg ﹒ g-1，RSD 為1.35%。結(jié)果表明: 該方法的重復(fù)性良好，符合含量測(cè)定要求。

2.8 回收率試驗(yàn): 取已知含量供試品粉末(批號(hào): 130910)約0.06g，精密稱定，共6 份，置于具塞錐形瓶中，每份精密加入膽紅素對(duì)照品一定量。分別按“2.2”方法制備供試品溶液，各精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為97.50%，RSD 為1.85%。結(jié)果表明: 該方法的準(zhǔn)確度良好，符合含量測(cè)定要求。見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 供試品含量測(cè)定: 取不同批號(hào)的供試品約0.12g，精密稱定，各兩份，分別按“2.2”方法制備供試品溶液，各吸取溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算膽紅素的含量。按照《中國(guó)藥典》2010 版一部的規(guī)定，人工牛黃中含膽紅素不得低于0.63%計(jì)算，菊花七味膠囊中膽紅素含量應(yīng)不得低于0.7269mg·g-1。測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 提取時(shí)間的選擇: 實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲提取的時(shí)間進(jìn)行了考察，比較了20min、30min 和40min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲30min 提取效果最好。

3.2 流動(dòng)相的選擇: 通過參考文獻(xiàn)，比較了不同的流動(dòng)相: 甲醇: 乙睛: l % 冰乙酸(88 : 10 : 2 );甲醇: 三氯甲烷: 1%磷酸溶液(81: 13: 6);甲醇: 三氯甲烷: 1%磷酸溶液(72: 25: 3);結(jié)果表明: 用甲醇: 三氯甲烷: 1%磷酸溶液(72: 25: 3)為流動(dòng)相保留時(shí)間適宜，分離效果好。

3.3 研究展望: 本實(shí)驗(yàn)以人工牛黃中膽紅素為研究對(duì)象進(jìn)行含量測(cè)定，為了更加全面的提高該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有待于進(jìn)一步對(duì)其他組分進(jìn)行綜合研究，必要時(shí)可對(duì)菊花七味膠囊進(jìn)行指紋圖譜的研究。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥標(biāo)準(zhǔn)［S］.1998.175.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典［S］.一部.2010: 5 -6.

［3］謝忱，劉殿奎，常嵐，等. HPLC 法測(cè)定蒙藥那如-5 膽紅素含量［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2011，(4): 64.

［4］丘振文，鐘瑜，羅丹冬，等.高效液相色譜法測(cè)定解毒西黃丸中人工牛黃的膽紅素含量［J］. 中藥新藥與 臨床藥理，2011，22(6): 666 -668.

［5］吳紅霞，付錦光.高效液相色譜法測(cè)定西黃片中人工牛黃的膽紅素含量［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009(4): 39 -41.

［6］李瑞萍，白音夫，趙陽，等. HPLC 測(cè)定蒙藥三臣丸膽紅素含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(6): 112 -113.

［7］鄧群英，曾凡紅，齊皓，等.高效液相法測(cè)定牛黃上清片中膽紅素的含量［J］.健康必讀，2011(8): 26 -28.

［8］吳琳，陳國(guó)章.高效液相色譜法測(cè)定氯芬黃敏片中膽紅素含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18(10): 48 -49.