HPLC 法測定蒙藥連翹四味湯散劑中連翹苷含量

劉 芳 白玉華

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010063)

連翹四味湯散劑(蘇龍嘎-4)收載于蒙藥分冊107頁。由連翹、拳參、木通、麥冬組成。蒙醫(yī)用于腸熱，痢疾，腹痛，腹瀉。方中連翹所占比例較大應(yīng)為主要藥材。原標(biāo)準(zhǔn)僅有薄層鑒別方法，無相對含量檢測方法。本文參照《中國藥典》2010 年版一部連翹相關(guān)品種含量測定方法，選擇連翹苷作為指標(biāo)性成分對本制劑中的連翹苷行高效液相色譜(HPLC)法含量測定。經(jīng)分析驗(yàn)證，該方法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，方中其它組分對連翹苷測定無干擾。

1 儀器與試藥

1.1 儀器: 1100 型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，NC-2000 型色譜工作站(大連中北科學(xué)技術(shù)公司)，IN -180 型柱溫箱(上海英泰科技研究所)，SH6150D 超生波清洗器(上海昆山)，梅特勒電子天平(d =0.1mg)，TG332A型光電天平(d=0.01mg)。

1.2 試劑與試藥: 連翹苷對照品(批號: 0821 -200104 供含量測定用)由中國藥品生物制品檢定所提供;乙腈為色譜純;水為高純水;其他試劑均為分析純。連翹四味湯散由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院提供，模擬制劑由內(nèi)蒙古中醫(yī)藥研究所藥物研究室提供。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件: 色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，試驗(yàn)采用非納米C18 (4.6mm×200mm，5μm)色譜柱;流動相為乙腈-水-磷酸(28: 2: 0.1);柱溫為30℃;檢測波長為277nm;理論板數(shù)按連翹苷峰算應(yīng)不低于3000。

2.2 測定溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備: 精密稱取連翹苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含1.04mg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備: 取本品2g，加甲醇10mL，稱重，超生處理(功率250W，頻率40kHz)40min，放冷，稱重，補(bǔ)足減失重量，濾過，取續(xù)濾液蒸至近干，加中性氧化鋁0.5g，攪拌，加到中性氧化鋁柱(100 ～200 目，2.5g，內(nèi)徑1.2cm)上，用70%乙醇80mL 洗脫，洗脫液蒸至干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL 量瓶內(nèi)稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察: 精密吸取對照品溶液0.25、0.5、1、2、4、6(mL)，分別置10mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10μL 進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，以峰面積積分值對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析。結(jié)果，連翹苷在0.026μg～0.624μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y =56070 +561423x r=0.9997。

2.4 精密度試驗(yàn): 取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定連翹苷峰面積積分值，RSD 為0.62%，精密度良好。

2.5 提取率的考察: 供試品分別進(jìn)行20、30、40、50 (min)的超聲提取考察，結(jié)果，30min 后連翹苷含量不再增加，確定40min 為最適合提取時(shí)間。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn): 取同一份供試品溶液，分別于0、2、6、8(h)進(jìn)行測定，結(jié)果，連翹苷在12h 內(nèi)的峰面積積分值基本穩(wěn)定不變。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn): 取同一批號供試品6 份，各約2.0g，精密稱定，分別按［2.2］方法制備供試品溶液，按上述條件測定。結(jié)果供試品平均含量為0. 39 mg·g-1)，RSD 為1.82%。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品6 份，各約2g，精密稱定，分別精密加入連翹苷對照品溶液(1.04mg·mL-1)1mL，加熱揮去甲醇溶液，其余按［2.2］方法試驗(yàn)，測定每份的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1 。

表1 回收率測定結(jié)果

2.9 樣品含量測定: 取醫(yī)院制劑3 批次(20100405、20110602 、20121207 )與模擬樣品3 批次(20121201、20121202、20121203)，按上述方法試驗(yàn)，含量分別為0.39、0.32、0.36(mg·g-1)，模擬供試品含量分別為0.45、0.46、0.42(mg·g-1)，6 批樣品平均含量0.40mg·g-1。

2.10 專屬性考察: 按［2.2］制備供試品溶液、對照品溶液、連翹陰性供試品溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀測定。結(jié)果表明，陰性對照在與連翹苷色譜峰相同的保留時(shí)間處無對應(yīng)峰干擾。見圖1、2、3

圖1 對照品HPLC 圖譜

圖2 供試品HPLC 圖譜

圖3 陰性對照HPLC 圖譜

2.11 耐用性實(shí)驗(yàn): 以Hypersil BDSC18 色譜柱，按上述方法測定含量。測定結(jié)果與Kromasil C18 色譜柱一致。

3 討 論

根據(jù)檢索，蒙藥連翹四味湯散劑暫無含量測定方法，本文在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上建立了制劑測定方法。方法學(xué)研究表明，該測定方法重現(xiàn)性好，雜質(zhì)少干擾小，同時(shí)相對延長色譜柱使用時(shí)間。

對制劑使用的連翹測定表明，連翹苷含量在0.19 ～0.24%，連翹苷含量均超過藥典要求標(biāo)準(zhǔn)0.15%。

有文獻(xiàn)報(bào)道，用一定比例甲醇的水溶液為溶劑，對藥材測定影響不大，對于復(fù)方制劑干擾成分多，不適宜本制劑的測定。