不同方式注射骨髓間充質(zhì)干細胞對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的療效

孫 輝，李 毅，孫 濤,安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，北京 00048；海軍總醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 00048

不同方式注射骨髓間充質(zhì)干細胞對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的療效

孫 輝1，李 毅2，孫 濤1,2
1安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，北京 100048；2海軍總醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100048

目的對比心臟注射和鼠尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stromal cells，BMSCs)對潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)大鼠模型的療效，并分析可能的治療機制。方法體外擴增培養(yǎng)雄性SD大鼠的BMSCs，用5%三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)/乙醇灌腸建立UC大鼠模型，并建立正常對照組D。造模后24 h，A組由心臟注射BMSCs懸液0.5 ml(含1×106個干細胞)，B組由鼠尾靜脈注射BMSCs懸液0.5 ml(含1×106個干細胞)，C組由鼠尾靜脈注射0.5 ml 0.9%氯化鈉注射液，計算各組大鼠的疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)。移植后7 d處死大鼠，光鏡下觀察結(jié)腸病理變化，及人性別確定區(qū)Y蛋白(human sex-determining region Y protein，SRY蛋白)、自殺相關(guān)因子(factor associated suicide，F(xiàn)AS)、G-蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat containing g protein coupled receptor 5，Lgr5)的表達。結(jié)果A組較B、C組DAI評分低(F=90.603，P＜0.05)，但A、B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。干細胞移植組大鼠均檢測到SRY蛋白，A組優(yōu)于B組；C組Fas表達高于D組(t=9.494，P＜0.05)，A、B組Fas表達較C組下調(diào)，且A組低于B組，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.6，P＜0.05)；A、B組LGR-5較C組表達明顯增加，且A組較B組高，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.7，P＜0.05)。結(jié)論心臟注射BMSCs對UC的療效優(yōu)于鼠尾靜脈注射；BMSCs可通過減輕腸道細胞凋亡、促進腸道干細胞再生起到對UC的治療作用。

骨髓間充質(zhì)干細胞；移植；潰瘍性結(jié)腸炎；大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因尚不十分清楚的慢性非特異性結(jié)直腸炎癥性疾病，難治愈，易復(fù)發(fā)，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。目前治療該病藥物有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，嚴重者行手術(shù)治療。這些方法雖然可緩解癥狀，但難以解決UC易復(fù)發(fā)的難題。近年來提出的干細胞療法為治療UC提供了新方向。本實驗對比心臟注射及鼠尾靜脈注射兩種方式對UC的療效，并分析研究可能的治療機制。

材料和方法

1 實驗動物 健康清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌性(6 ～ 8周齡)40只，雄性(3 ～ 4周齡)5只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于海軍總醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物實驗室。實驗前，動物在實驗條件下適應(yīng)環(huán)境1周，動物房溫度18 ～24℃，相對濕度50% ～ 55%，自然光照周期，予標準配方的普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。

2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Thermo，USA)，特級胎牛血清(Invitrogen，USA)，胰蛋白酶(Solarbio)，2，4，6-三硝基苯磺酸[trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)，Sigma]；PE標記小鼠抗大鼠CD34、CD44、CD45、CD90抗體；兔抗SRY-FITC、兔抗Fas單克隆抗體、兔抗LGR-5單克隆抗體、SP試劑盒和DAB染色劑：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

3 骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stromal cells，BMSCs)的分離培養(yǎng)及鑒定 將雄性(3 ～4周齡)5只SD大鼠頸椎脫臼處死后，置于75%乙醇中浸泡約5 min，于無菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨，用注射器沖出骨髓細胞后，離心1 000 r/min，5 min，棄上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，于37℃，5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)，并利用流式細胞儀檢測P3代細胞CD34、CD44、CD45、CD90的表達情況。

4 UC模型的建立及實驗動物分組 用三硝基苯磺酸/乙醇復(fù)合法建立UC大鼠模型[1]。大鼠造模前禁食不禁水48 h，禁食24 h后提起鼠尾將其懸空，使掙扎以排出大腸遠端的大便，共2次，每次間隔6 h以上，排空大便后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用外徑為2 mm的硅膠管插入大鼠肛內(nèi)約8 cm，經(jīng)管內(nèi)注入溶液0.6 ml(100 mg/kg TNBS + 50%乙醇)，約10 s灌注完畢。將造模成功的30只雌性SD大鼠隨機分為3組，A組(心臟注射干細胞移植)10只，B組(鼠尾靜脈注射干細胞移植)10只，C組(鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液)10只，以及D組(正常對照)10只。

5 疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分[2]造模后觀察大鼠的體質(zhì)量變化、糞便性狀及便血情況。DAI=(體質(zhì)量下降分數(shù)+糞便性狀分數(shù)+隱血分數(shù))/3。DAI評分標準：無體質(zhì)量下降、糞便性狀正常、無便血記為0分；體質(zhì)量下降1% ～ 5%記為1分；體質(zhì)量下降5% ～ 10%、稀便、糞便隱血(+)記為2分；體質(zhì)量下降11% ～ 15%記為3分；體質(zhì)量下降＞15%、腹瀉、便血記為4分(糞便性狀正常是成形糞便；稀便是糊便或者半成形糞便，但不黏附肛門；腹瀉是水樣便并且黏附肛門)。

6 BMSCs移植及取材 造模后24 h，將含1×106個BMSCs的懸浮液0.5 ml經(jīng)心臟注射于A組大鼠體內(nèi)，B組于鼠尾靜脈注射等量BMSCs，C組于鼠尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉注射液。觀察記錄大鼠毛發(fā)、體質(zhì)量、糞便性狀及便血情況，7 d時處死大鼠，取結(jié)腸組織分別經(jīng)液氮、4%甲醛固定，用于HE染色、SRY蛋白免疫熒光染色、Fas、LGR-5免疫組化染色。

7 免疫組化法評分 免疫組化采用SP三步法，具體操作步驟參見試劑盒說明書。高倍鏡下抽取5處評分，以胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒狀物者為陽性細胞，分別根據(jù)染色強度和陽性細胞比例進行評分，陽性細胞占同類細胞數(shù)＜5%為0分；5% ～ 25%為1分；26% ～ 50%為2分；51% ～ 75%為3分；＞75%為4分。胞質(zhì)染色陰性為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。最后將兩個分數(shù)相加。

8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，兩組或多組定量資料比較采用t檢驗或χ2分析，服從正態(tài)分布且方差齊性的計量資料，多樣本均數(shù)間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMSCs培養(yǎng)及鑒定 原代培養(yǎng)的BMSCs約12 h開始貼壁，72 h后大量貼壁，呈短梭形，傳代純化后大部分呈長梭形，漩渦狀生長(圖1)。取3代細胞行流式細胞術(shù)檢測，BMSCs表面標記物CD34陽性率為0.78%、CD44陽性率99.38%、CD45陽性率0.43%、CD90陽性率為98.78%(圖2)。

2 DAI評分 造模前大鼠飲食、活動及糞便性狀正常，毛色光澤，體質(zhì)量正常。造模后1 d大鼠開始出現(xiàn)懶動，厭食，糞便次數(shù)增多，軟便或質(zhì)稀，隱血試驗陽性或黏液膿血便等現(xiàn)象，3 d后癥狀達到高峰，大鼠毛發(fā)無光澤、變脆，懶動扎堆，糞便完全為稀便。之后大鼠飲食、活動、體質(zhì)量逐漸增加，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，糞便性狀逐漸恢復(fù)，對照組大鼠糞便無變化，體質(zhì)量略增加。7 d時A組DAI評分(1.53±0.28)較B組(1.66±0.22)、C組(2.93±0.26)均低，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=90.603，P＜0.05)，但A、B組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 組織病理學(xué)觀察 取結(jié)腸組織行HE染色，A組結(jié)腸鏡下見上皮破損范圍較小，黏膜及黏膜下層見炎性細胞浸潤，B組鏡下上皮破損范圍較大，黏膜及黏膜下大量炎性細胞浸潤，C組鏡下可見巨大潰瘍，大量炎性細胞浸潤；D組鏡下見結(jié)腸上皮完整，固有層腺體形態(tài)正常排列整齊，黏膜及黏膜下層可見少量炎癥細胞浸潤，未見糜爛及潰瘍。見圖3。

4 SRY蛋白免疫熒光檢查 移植組大鼠結(jié)腸組織均可檢測到SRY熒光蛋白，部分陽性細胞呈簇排列，模型組大鼠未能在組織中檢測到SRY蛋白。見圖4。

5 Fas免疫組化檢查 C組Fas大量表達，正常對照組僅有少量Fas表達(t=9.494，P＜0.05)；A、B組Fas表達較C組下調(diào)，且A組表達較B組低，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.6，P＜0.05)。見表1，圖5。

6 LGR-5免疫組化檢查 正常對照組LGR-5有少量表達，A、B組較C組表達明顯增加，且A組含量較B組高，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.7，P＜0.05)。見表1，圖6。

表1 各組免疫組化評分Tab. 1 Immunohistochemical score of rats in 4 groups (±s)

表1 各組免疫組化評分Tab. 1 Immunohistochemical score of rats in 4 groups (±s)

aP＜0.05, vs group B;aP＜0.05, vs group C;bP＜0.05, vs group C;cP＜0.05, vs group D

Group (n=10)FasLGR-5 A 2.2±0.45a5.4±0.55aB 4.0±0.71b4.0±1.00bC 5.8±0.84c1.8±0.84 D 0.4±0.550.8±0.84

圖 1 培養(yǎng)3 d的P3-BMSCs (×100)Fig. 1 P3-BMSCs cultured for 3 days (×100)

討 論

UC是一種慢性非特異性炎癥性疾病，其發(fā)病機制是多方面的，目前認為其可能與免疫、遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)[3-7]。目前，治療UC的方法療效有限，且不良反應(yīng)難以避免，因此探究一種新的治療方法相當必要。

BMSCs跨胚層橫向分化的可塑性、強大的分化潛能及低免疫原性使其在細胞再生和免疫調(diào)節(jié)方面有廣泛的應(yīng)用前景[8-10]。近年，已有大量實驗證明，BMSCs可促進實驗性結(jié)腸炎模型腸道修復(fù)[11-16]。在干細胞移植的基礎(chǔ)實驗中，尾靜脈注射是主要途徑，但尾靜脈注射的BMSCs大部分聚集于肺、腎、肝等器官，僅有少量出現(xiàn)在結(jié)腸，因此，探究新的注射方式就尤為必要。隨著介入技術(shù)在臨床的應(yīng)用，通過動脈系統(tǒng)注射藥物越來越受到重視，其可使藥物快速到達靶器官，減少轉(zhuǎn)運途中的損失。但在動物實驗中，技術(shù)、儀器有限，因此，本實驗通過心臟注射和鼠尾靜脈注射兩種方式注射BMSCs到大鼠體內(nèi)，對比療效，并從BMSCs促進腸道干細胞增殖、減輕腸道細胞凋亡方面探討B(tài)MSCs治療UC的可能機制。

移植BMSCs后，觀察大鼠體質(zhì)量變化，糞便性狀及便血情況，7 d時A組較B組、C組DAI評分均低(F=90.603，P＜0.05)，但A、B組間無明顯差異，HE染色發(fā)現(xiàn)A、B組結(jié)腸病理差異明顯。因此我們推測心臟注射BMSCs可減少其在肺部的損失，到達腸道的細胞量多于鼠尾靜脈注射的量，可更好改善UC大鼠病理損傷，但因治療時間不足，臨床改善不明顯。通過檢測腸道干細胞標記物LGR-5，發(fā)現(xiàn)A、B組腸道黏膜上皮LGR-5高于C組，且A組高于B組，表明移植明顯促進受損腸道黏膜組織內(nèi)腸道干細胞增殖，這與Nishida等[17]的研究一致。因此我們推測心臟注射干細胞的效果優(yōu)于鼠尾靜脈注射，BMSCs可以促進腸道干細胞的增殖，但其是否分化為結(jié)腸黏膜上皮，尚需進一步研究。Fas是細胞凋亡相關(guān)蛋白之一，其配體Fas Ligand主要存在于被炎癥介質(zhì)激活的T淋巴細胞(尤其是T輔助細胞Th1)和自然殺傷(natural killer，NK)細胞上，已有研究證實BMSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過調(diào)節(jié)樹突狀細胞的增殖、活化，間接或直接影響T細胞、B細胞和NK細胞等細胞的增殖、活化及細胞因子的分泌[18]。本實驗研究表明，A、B組Fas免疫組化評分低于C組，且A組低于B組，表明心臟注射優(yōu)于鼠尾靜脈注射，BMSCs可能通過對免疫炎癥細胞的阻斷從而減輕細胞凋亡。但也有研究表明關(guān)于BMSCs抗凋亡的機制可能與其分泌胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、肝細胞生長因子等有關(guān)[19-20]。

圖 2 流式細胞術(shù)檢測大鼠第3代BMSCs表面CD抗原的表達Fig. 2 Expression of markers CD34, CD44, CD45 and CD90 of BMSCs in rats tested by flow cytometry

圖 3 大鼠結(jié)腸組織病理改變(HE×200) A： 心臟注射組； B： 鼠尾靜脈注射組； C： 模型對照組； D： 正常對照組Fig. 3 Pathological-changes in colon of rats (HE staining×200) A: Intracardiac injection group; B: Intravenous injection group; C: Model control group; D: Normal control group

圖 4 大鼠結(jié)腸組織SRY蛋白的表達(免疫熒光×200) A： 心臟注射組； B： 鼠尾靜脈注射組； C： 模型對照組； D： 正常對照組Fig. 4 Expression of SRY protein in colon of rats (immunofluorescence staining×200) A: Intracardiac injection group; B: Intravenous injection group; C: Model control group; D: Normal control group

圖 5 光鏡下大鼠結(jié)腸組織Fas的表達(免疫組化×200) A：心臟注射組； B： 鼠尾靜脈注射組； C： 模型對照組； D： 正常對照組Fig. 5 Expression of Fas in colon of rats (immunohistochemical staining×200) A: Intracardiac injection group; B: Intravenous injection group; C: Model control group; D: Normal control group

圖 6 大鼠結(jié)腸組織LGR-5的表達(免疫組化×200) A：心臟注射組； B： 鼠尾靜脈注射組； C： 模型對照組； D： 正常對照組Fig. 6 Expression of LGR-5 in colon of rats (immunohistochemical staining×200) A: Intracardiac injection group; B: Intravenous injection group; C: Model control group; D: Normal control group

綜上所述，心臟注射BMSCs可減少其在大鼠肺部的損失，增加其向受損腸道的聚集，參與腸道組織損傷的修復(fù)，促進腸道干細胞增殖，減輕腸道細胞凋亡，加速腸道修復(fù)，較鼠尾靜脈注射的療效更優(yōu)。但其是否可分化成腸道干細胞，將在后續(xù)研究中予以關(guān)注。

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Comparison of therapeutic effects in different ways of bone marrow mesenchymal stromal cells injection in rats with ulcerative colitis

SUN Hui1, LI Yi2, SUN Tao1,2
1Affiliated Clinical Faculty of Navy General Hospital, Anhui Medical University, Beijing 100048, China;2Department of Gastroenterology, PLA Navy General Hospital, Beijing 100048, China

SUN Tao. Email: drsuntao1@163.com

ObjectiveTo compare the efficacy of intracardiac injection and intravenous injection of bone marrow mesenchymal stromal cells (BMSCs) in rats with ulcerative colitis (UC) and analyze the therapeutic mechanism.MethodsBMSCs from SD male rats were in vitro cultured. The rat model of UC was established by 5% trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)/ethanol enema. Group D was the control group. And 24 hours later, rats of group A were injected with 0.5 ml of BMSCs suspension via the heart (1×106). Rats of group B were injected with 0.5 ml of BMSCs suspension via tail vein (1×106). Rats of group C were injected with equal volume of normal saline via tail vein. Disease activity index (DAI) of rats in every group was observed and calculated. The rats were sacrificed at day 7 after injection. The pathological changes of the colon and the expression of human sex-determining region Y protein (SRY protein), factor associated suicide (FAS), leucine-rich repeat containing g protein coupled receptor 5 (Lgr5) were observed under microscope.ResultsDAI of group A was lower than that of group B and C (F=90.603, P＜0.05) but there were no differences between group A and B. The repairing of injured colon in group A was much better than in group B. The SRY protein could be detected in transplantation group. Compared with the control group, the expression of Fas in group C increased (t=9.494, P＜0.05). Compared with group C, the expression of Fas in treatment group decreased. And the expression in group A was lower than in group B. There were significant difference among the three groups (F=38.6, P＜0.05). Compared with group C, the expression of LGR-5 in treatment group was significantly increased. And the expression in group A was higher than in group B. There were significant difference among the three groups (F=24.7, P＜0.05).ConclusionThe efficacy of intracardiac injection of BMSCs is much better than the efficacy of intravenous injection in rats with UC. BMSCs plays a therapeutic role in rats with UC by reducing intestinal cells apoptosis and promoting intestinal stem cell regeneration.

bone marrow mesenchymal stromal cells; transplantation; ulcerative colitis; rats

R 574.1；R 332

A

2095-5227(2014)11-1155-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.020

時間：2014-07-18 10:15 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140718.1015.001.html

2014-05-05

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金項目(2009-3083)

Supported by Capital Medical Development and Research Foundation of Beijing(2009-3083)

孫輝，女，在讀碩士。研究方向：炎癥性腸病。Email: sunhui5625@126.com

孫濤，男，博士，主任醫(yī)師，副院長。Email: drsuntao1@163.com