改良CT A B法對提取玫瑰D NA質(zhì)量的影響

嚴廷良，許惠秋，張穎，修效中，苗啟晨，李蕾*

（1.海南師范大學生命科學學院，海南海口571158；20三亞蘭德種業(yè)有限公司，海南三亞572000

改良CT A B法對提取玫瑰D NA質(zhì)量的影響

嚴廷良1，許惠秋2，張穎1，修效中1，苗啟晨1，李蕾1*

（1.海南師范大學生命科學學院，海南海口571158；20三亞蘭德種業(yè)有限公司，海南三亞572000

玫瑰（Rosa rugosa）組織色素較多，富含酚類物質(zhì).為了提取適于SRAP分析的高質(zhì)量的玫瑰DNA，本實驗基于CTAB法，在濃度2%和3%CTAB基礎上，設計不同濃度的β-巰基乙醇和PVP抗氧化劑進行5種組合，研究了β-巰基乙醇和PVP對玫瑰DNA提取質(zhì)量的影響.結(jié)果表明，在3%CTAB提取液中添加適量的β-巰基乙醇和PVP能獲得純度較高的玫瑰DNA，在組合III（3% CTAB、2%β-巰基乙醇+10%PVP）中，DNA電泳譜帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，SRAP分子標記效果較好，DNA的質(zhì)量和純度均滿足于SRAP技術(shù)和DNA指紋圖譜研究的要求.

玫瑰；DNA；β-巰基乙醇；PVP

玫瑰（Rosa rugosa）是我國傳統(tǒng)名花，有著2000余年的栽培歷史[1]，目前主要是作為園林綠化材料和食品、香料工業(yè)重要原料，我國是重要的玫瑰原產(chǎn)地之一，擁有非常豐富的玫瑰種質(zhì)資源.但由于其分布地域較廣、繁殖方式多樣，使得品種間的親緣關(guān)系模糊不清[2]，同時由于大部分玫瑰品種在形態(tài)上非常接近，或同一品種在不同地區(qū)皆有栽培，存在“同名異物”、“同物異名”現(xiàn)象，使玫瑰品種鑒定存在一定困難，分子生物學技術(shù)的發(fā)展已成為解決該問題的重要方法，因此，很有必要對玫瑰品種進行分子生物學研究分析.

相關(guān)擴增多態(tài)性（SRAP）是2001年由Li和 Quiros[3]開發(fā)的一種基于PCR的分子標記技術(shù)，其優(yōu)點在于準確率高和穩(wěn)定性較強，在反映物種形態(tài)學變異和進化歷史方面提供的信息比RAPD和AFLP更豐富[4]，較適于檢測物種之間親緣關(guān)系和比較近的品種之間的差異[5]，故采用SRAP技術(shù)對玫瑰品種進行遺傳多樣性分析可以更好地揭示玫瑰的親緣關(guān)系.

植物組織中含有大量多糖、多酚、酯類等次生代謝產(chǎn)物,要從中提取高質(zhì)量的DNA比較困難，特別是玫瑰中，含有大量的玫瑰色素和較高的酚基、酚羥基等酚類化合物[6].目前多這類植物研究中使用試劑盒的提取方法比較多見，傳統(tǒng)的CTAB方法越來越少用，李金璐等對CTAB法的改良過程中表明經(jīng)過改良的CTAB法提取DNA成本遠低于試劑盒法，且提取出的DNA質(zhì)量較高[7].

本實驗在常用CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[8]的基礎上對不同濃度的β-巰基乙醇和PVP設計5種DNA提取方案，通過比較分析，確定出最佳的適用于SRAP分子標記技術(shù)的玫瑰總DNA的提取方法，為其分子生物學研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為2012年采自三亞亞龍灣國際玫瑰谷共200個玫瑰品種，隨機選取3個品種作為供試材料（A：伯尼卡（R rugosa‘Bonica），B：冰山（R rugosa‘Flceberg），C：芬德拉（R rugosa‘Vendela）），供試材料均為嫩葉.

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰DNA的提取

采用傳統(tǒng)CTAB法進行改良，從新鮮玫瑰葉片中提取基因組DNA，對PVP、β-巰基乙醇和CTAB的濃度進行改良，優(yōu)化提取液，每個處理，每個材料重復3次.具體改良方案和步驟如下：

提取出來的DNA用2%瓊脂糖凝膠再110V電壓200mA電流下進行電泳，電泳結(jié)束后，用Alpha Imager IS-2200凝膠成像系統(tǒng)拍照將結(jié)果，用島津公司Uvmini-1240型紫外分光光度計檢測后計算DNA溶液濃度與純度，-20℃保存?zhèn)溆?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物（參照徐大宗等）[2].

表1 五種改良的提取液方案Tab.1Five kinds of modified extract solution

1.2.2 玫瑰樣品DNA進行SRAP-PCR擴增

SRAP-PCR反應體系為：引物0.9μmol/L、dNTPs 200μmol/L、Mg2+1.6mmol/L、模板DNA 15 ng，TaqDNA聚合酶1.0μL、總體積為10μL.SRAP-PCR反應程序參照徐大宗等[2]，30個循環(huán).并用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物和銀染法染色.實驗所用引物堿基序列參照Li和Quiros[3].

1.2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

利用軟件Gel2.0識別凝膠電泳圖并與標準圖譜進行比對（參照徐大宗等）[2].

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA的提取結(jié)果

用5種處理方法，提取3個材料，每個處理及重復稱取葉片0.5g，DNA濃度及質(zhì)量用核酸蛋白儀進行測定.結(jié)果見表2，A材料，每個處理下DNA質(zhì)量（A260/A280）都較低（<1.8），濃度在46~300ng/μL之間.較好的是IIA（A260/A280=1.65），顯著高于其他處理.B材料5個處理中，II、III和IV處理效果較好，A260/A280比值在1.6-1.88之間，濃度在125~580ng/ μL之間.C材料5個處理中，III處理效果較好，A260/ A280比值為1.89，顯著高于其他處理組，濃度為109 ng/μL.結(jié)果表明，III處理方法效果比較好，可用于大量玫瑰材料的DNA提取.

表2 不同提取液對玫瑰DNA提取量及純度的影響Tab.2Influence of different extract solution on the roses DNA extraction amount and purity

2.2 DNA樣品SRAP-PCR擴增結(jié)果及多態(tài)性信息

選取提取液III提取玫瑰樣品DNA進行SRAPPCR擴增，SRAP引物參照Li和Quiros[3]，凝膠電泳結(jié)果經(jīng)銀染后見圖1.

從圖1可以看出采用III處理效果方法提取的DNA用于SRAP-PCR擴增效果較好，條帶清晰，多態(tài)性條帶豐富，可用于SRAP分子標記.

用8對引物（Me1-Em3、Me2-Em7、Me2-Em9、Me5-Em8、Me6-Em8、Me8-Em9、Me5-Em9、Me6-

Em10）篩選184份玫瑰材料，結(jié)果表明所檢測的玫瑰品種間存在較豐富的遺傳多樣性和復雜的遺傳背景，引物組合Me2-Em7擴增出的的多態(tài)性位點最多，多態(tài)位點百分率最高.三對引物組合（Me1-Em3、Me2-Em7、Me2-Em9）擴增效果都較好（見表3），可用于對玫瑰品種遺傳多樣性分析.

圖1 SRAP分子標記圖，引物Me1-Em3擴增部分結(jié)果Fig.1Molecular marker map of SRAP and the amplification result of some Me1-Em3

表3 不SRAP引物擴增結(jié)果及多態(tài)性信息Tab.3Results and the polymorphism information of SRAP primers

2.3 玫瑰品種指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)篩選出的3對引物組合：Me1-Em3、Me2-Em7、Me2-Em9.利用軟件Gel2.0對擴增的凝膠電泳圖進行識別處理，總共建立了184個玫瑰品種的標準DNA指紋圖譜（部分品種標準指紋圖譜見圖2）.本實驗結(jié)果經(jīng)鑒定表明，當相似度為95%時，該指紋圖譜的鑒別準確率達100%，準確率較高，故篩選出的3對引物組合可用于玫瑰品種的鑒定.

3 結(jié)果與討論

圖2 部分品種標準DNA指紋圖譜參照（50 bp Marker）Fig.2The standard DNA fingerprint of some cultivars（50 bp Marker）

玫瑰中含有較高的色素，玫瑰色素的主要成分是山茶黃素和榭皮黃素類化合物R[9]，還含有較高的酚基、酚羥基等酚類化合物[10]，導致所提的DNA中的色素和酚類物質(zhì)含量較高，不符合外源DNA導入和DNA分析的純度要求.目前對植物DNA提取中酚類物質(zhì)的去除，一般都是在提取液中加入適量的抗氧化劑和螯合物，防止多酚氧化褐變用的較多是試劑是β-巰基乙醇和PVP，其中β-巰基乙醇是作為一種強還原劑來保護DNA免受醌類物質(zhì)、二硫化物、多酚氧化酶等物質(zhì)的損害，防止酚氧化；PVP是一種酚的絡合物，可與酚類物質(zhì)結(jié)合，有效地抑制酚類物質(zhì)的氧化，從而減少酚類物質(zhì)的含量，起到純化樣品的作用[11].本實驗中發(fā)現(xiàn)沒有加PVP的樣品中，在用冷無水乙醇沉淀時，得到的DNA不是透明絲狀，而是像膠水呈粘稠狀，多糖將DNA繞裹在一起，而加入10%的PVP后.所以CTAB和PVP在DNA提取過程中對富含多酚、色素的植物DNA提取過程中均有明顯的純化效果.本試驗中對提取液采用不同濃度的β-巰基乙醇與PVP組合，進行多次重復試驗，從提取DNA的純度、濃度結(jié)果表明在III種提取液組合中（3%CTAB+2%β-巰基乙醇+10%PVP）提取玫瑰DNA效果較好.經(jīng)SRAP-PCR分子標記效果圖結(jié)果顯示，試驗的玫瑰品種SRAP標記都顯示出清晰豐富多態(tài)性條帶，可用于SRAP分子標記，篩選出適合SRAP分析用的高質(zhì)量玫瑰基因組DNA提取的有效方法，通過這個改良方法提取的玫瑰DNA可較好地應用于遺傳多樣性分析和品種指紋圖譜的構(gòu)建，為進一步開展玫瑰的分子生物學研究奠定基礎.

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責任編輯：黃瀾

Effect of the Modified CTAB Method on DNA Quantity From

YAN Tingliang1，XU Huiqiu2，ZHANG Ying1，XIU Xiaozhong1，MIAO Qichen1，LI Lei1*
（1.College of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China；2.Sanya Land Seed Limited Corporation，Hainan，Sanya 572000，China；）

Rosa rugosa is the plant with high phenolic substance and pigment.In order to extract the high quality DNA suitable for SRAP analysis,the modified method was used with 5 kinds of combinations of different concentration of β-mer?captoethanol and PVP and 2%or 3%CTAB.The results showed that it can get the high purity rose DNA from the extracts of the combination of 3%CTAB+2%β-mercaptoethanol+10%PVP.Furthermore,the electrophoresis bands of DNA were clear and exhibited no significant tailing phenomenon.The average yield of rose DNA can meet the quality and purity in SRAP technical and DNA fingerprint requirements.

Rosa rugosa；DNA；β-mercaptoethanol；PVP

Q 781

A

1674-4942（2014）04-0412-04

2014-08-19

三亞市專項科研試制項目（2012KS09）；大學生國家級創(chuàng)業(yè)訓練項目（201311658034）

*通訊作者