羊棲菜聯(lián)合姬松茸多糖對胰島β細(xì)胞保護(hù)作用*

張 杰，楊旭東**，申梅淑，宋高臣，王桂云， 石 杰，田麗梅，楊驕霞，詹必勛

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011； 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011； 3.牡丹江血栓病醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

〈生理生化〉

羊棲菜聯(lián)合姬松茸多糖對胰島β細(xì)胞保護(hù)作用*

張 杰1，楊旭東1**，申梅淑1，宋高臣1，王桂云1， 石 杰1，田麗梅1，楊驕霞2，詹必勛3

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011； 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011； 3.牡丹江血栓病醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

探討羊棲菜多糖、姬松茸多糖對高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。將胰島β細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常對照組、模型組、SFPS組、ABP組、兩藥聯(lián)合組。應(yīng)用MTT法檢測對胰島β細(xì)胞增殖能力的影響，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測胰島β細(xì)胞凋亡情況，并用RT-PCR法檢測bax、caspase-3基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，SFPS、ABP能明顯減輕高糖對胰島βTc3細(xì)胞的生長抑制，抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，并明顯降低bax、caspase-3基因表達(dá)(p<0.01)，兩藥聯(lián)合作用更明顯，其作用機(jī)制可能與調(diào)控bax、caspase-3基因表達(dá)有關(guān)。

羊棲菜多糖；姬松茸多糖；胰島細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；βTc3細(xì)胞

2型糖尿病是1種復(fù)雜的代謝紊亂性疾病，發(fā)病機(jī)理至今尚未闡明，胰島素抵抗出現(xiàn)在肥胖患者和少數(shù)非肥胖患者身上，但無論是否肥胖都會出現(xiàn)進(jìn)行性的胰島β細(xì)胞損傷[1]，因此在2型糖尿病研究中，研究胰島β細(xì)胞功能及損傷有重要的意義。羊棲菜多糖(SargassumfusiformePolysaccharide，SFPS)是從海藻羊棲菜中提取的多糖，有研究發(fā)現(xiàn)其具有降血糖、治療糖尿病合并癥等作用[2，3]，姬松茸多糖(AgaricusblazeiMurill Polysaccharide，ABP)，為蘑菇科、蘑菇屬真菌姬松茸的主要有效成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖等作用[4]。但SFPS 聯(lián)合ABP是否具有保護(hù)高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞的作用及其機(jī)制，尚未見進(jìn)一步報道。本實驗從細(xì)胞及分子水平上，探討SFPS聯(lián)合ABP對胰島β細(xì)胞功能的作用及可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用SFPS聯(lián)合ABP治療糖尿病提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞

小鼠βTc3 細(xì)胞系，購自北京欣源佳和生物科技有限公司。

1.2 實驗藥品

RNA提取試劑(Trizol)及四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)，購自美國Sigma公司；熒光染料(Hoechst33258)，購自百浩生物科技有限公司；引物核苷酸片段，購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠βTc3細(xì)胞培養(yǎng)于 RPMI-1 640 培養(yǎng)液(100 mL·L-1胎牛血清)，于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，4 d～5 d 培養(yǎng)1代，2 d 換液1次。

1.4 實驗分組

取生長良好的βTc3細(xì)胞用于實驗，實驗分為5組。A組(正常對照組)：完全 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組(模型組)：33.3 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)；C組(SFPS組)：33.3 mmol·L-1葡萄糖和 500 mg·L-1SFPS培養(yǎng)；D組(ABP組)：33.3 mmol·L-1葡萄糖和 200 mg·L-1ABP培養(yǎng)；E組(SFPS+ABP組)：33.3 mmol·L-1葡萄糖和 500 mg·L-1SFPS+200 mg·L-1ABP培養(yǎng)。各組加藥后培養(yǎng)基培養(yǎng) 12 h。

1.5 MTT法測定βTc3細(xì)胞增殖抑制率

收集βTc3細(xì)胞 200 μL，0.25%胰蛋白酶消化，接種于96孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞濃度為1×105個·mL-1，每個劑量設(shè)12個平行孔，按上述分組處理細(xì)胞 12 h 后，除調(diào)零組外，其他各組分別加入 5 g·L-1的MTT 20 μL，4 h 后，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL·孔-1，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀 450 nm，測定各孔吸光度值(A)，用RPMI-1 640 培養(yǎng)液調(diào)零，檢測SFPS對βTc3細(xì)胞增殖的影響。按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率(Inhibition Rate，IR)，公式為：

IR=(A1-A2)(A1-A0)×100%

式中：A1表示對照組吸光度值；A2表示實驗組吸光度值；A0表示空白組吸光度值。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

收集不同組的βTc3細(xì)胞，胰酶消化，pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，固定液(甲醇冰醋酸=3∶1)4℃固定 10 min，蒸餾水沖洗3遍。然后用 5 mg·L-1Hoechst 33258 染色，在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃染色 15 min，用蓋玻片封片后，放置于熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取10個視野計算凋亡率，熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色深染。凋亡率(P)公式為：

P=N1[(N1+N2)]×100%

式中：N1表示凋亡細(xì)胞數(shù)；N2表示正常細(xì)胞數(shù)。

1.7 RT-PCR測定caspase-3、bax基因的表達(dá)

caspase-3上游引物：5’-AGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3’；下游引物：5’-CGGGATC TGTTTCTTTGCAT-3’，擴(kuò)增片段 342 bp。bax上游引物：5’-GACACCTGAGCTGACCTTG G-3’；下游引物：5’-GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC-3’，擴(kuò)增片段 310 bp。β-actin，上游引物：5’-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3’，下游引物：5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3’，擴(kuò)增片段 838 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，94℃反應(yīng) 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)，72℃復(fù)性 10 min。經(jīng)17%瓊脂糖凝膠電泳分離后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，分別計算caspase-3β-actin和baxβ-actin的灰度比值作相對定量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胰島βTc3細(xì)胞增殖抑制率

藥物作用于高糖培養(yǎng)的胰島βTc3細(xì)胞 12 h 后，實驗結(jié)果見表1。

表1 藥物對胰島βTc3細(xì)胞增殖抑制率的影響

注：與模型組比較，*p<0.01。

由表1可見，與模型組比較，藥物各組均能減輕高糖對胰島βTc3細(xì)胞的生長抑制作用(p<0.01)，SFPS+ABP組對減輕高糖對胰島βTc3細(xì)胞的生長抑制效果最明顯。

2.2 熒光顯微鏡檢測βTc3細(xì)胞凋亡情況

藥物作用于高糖培養(yǎng)的胰島βTc3細(xì)胞 12 h 后，熒光顯微鏡檢測βTc3細(xì)胞凋亡情況見圖1、圖2。

實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)的各組細(xì)胞均可見凋亡細(xì)胞，但凋亡率各不相同，與正常對照組凋亡率(3.95%)比較，模型組凋亡率(21.57%)明顯升高，說明高糖可以誘導(dǎo)βTc3細(xì)胞凋亡；SFPS組凋亡率為13.98%，ABP組凋亡率為12.36%，SFPS+ABP組凋亡率為10.03%，與模型組比較，SFPS+ABP組降低凋亡率效果最明顯(p<0.01)。

2.3 各組中caspase-3、bax基因表達(dá)情況

在胰島βTc3細(xì)胞中，bax、caspase-3基因mRNA表達(dá)的變化情況見表2。

表2 胰島βTc3細(xì)胞中bax、caspase-3基因(mRNA表達(dá)變化

注：與正常對照組比較，*p<0.01；與模型組比較，#p<0.01。

凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組caspase-3和bax基因mRNA的表達(dá)明顯增加(p<0.01)；與模型組比較，不同藥物組caspase-3和bax基因mRNA的表達(dá)明顯減少，SFPS+ABP組降低caspase-3和bax基因mRNA的表達(dá)最明顯(p<0.01)。

3 討論

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是1種代謝紊亂性疾病，在人群中的發(fā)病率正逐年上升，其中95%為2型糖尿病。以往對2型糖尿病研究主要集中在胰島素分泌不足及胰島素抵抗上，但對胰島β細(xì)胞功能異常的作用卻被忽視。但胰島β細(xì)胞功能異常在2型糖尿病發(fā)生中起著非常重要作用，持續(xù)高血糖可誘導(dǎo)并加重β細(xì)胞功能損害[5]，繼而發(fā)生衰竭，最終發(fā)展成為2型糖尿病[6，7]，而細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長抑制是細(xì)胞損傷的2種重要方式。

細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，是由一系列半胱氨酸蛋白酶(caspase)級聯(lián)反應(yīng)高度調(diào)控的，激活caspase是細(xì)胞凋亡的不可抑制步驟[8]，是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)的caspase家族成員有14種，caspase-3是家族中最重要的，通常以酶原的形式存在，在誘導(dǎo)因素的作用下，caspase-3酶原由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中被激活，活化的caspase-3可以在一些重要的蛋白質(zhì)的天冬氨酸殘基切斷肽鍵，改變其結(jié)構(gòu)，影響信號分子，引起細(xì)胞凋亡[9]，所以caspase-3是凋亡反應(yīng)的最關(guān)鍵的酶即核心酶。bax是bcl-2家族的促凋亡蛋白，在凋亡刺激信號的刺激下，bax的促凋亡作用是以自身形成bax-bax同源二聚體的形式，激活caspase-3活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SFPS能降低胰島βTc3的增殖抑制率，降低其細(xì)胞凋亡，并增加bax和caspase-3基因的表達(dá)。

本實驗以高濃度葡萄糖( 33.3 mmol·L-1)體外培養(yǎng)胰島βTc3細(xì)胞，模擬糖毒性誘導(dǎo)βTc3細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示與正常對照組比較，高糖培養(yǎng)的模型組中的βTc3細(xì)胞凋亡率明顯增高，胰島βTc3細(xì)胞的生長明顯受到抑制，說明持續(xù)高血糖可誘導(dǎo)βTc3細(xì)胞凋亡并加重β細(xì)胞功能損害。分別選用SFPS、ABP及SFPS+ABP聯(lián)合培養(yǎng)胰島βTc3細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物組凋亡率和生長抑制率明顯低于高糖培養(yǎng)的模型組，說明SFPS、ABP可以改善高糖誘導(dǎo)的βTc3細(xì)胞凋亡和β細(xì)胞功能損害，但SFPS+ABP聯(lián)合作用效果最明顯。

綜上所述，SFPS+ABP聯(lián)合能明顯降低胰島βTc3細(xì)胞的bax和caspase-3基因的表達(dá)，這提示其降低糖毒性引起的胰島βTc3細(xì)胞的生長抑制和細(xì)胞凋亡，可能與其調(diào)控，bax和caspase-3基因的表達(dá)有關(guān)。然而，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步實驗研究。

[1]Vialettes B,Valero R.Early stages of β-cell deficiency:the anticipated chronicle to type 2 diabetes[J].Diabetes Med,2003,29(23):11-15.

[2]張信岳，程敏，孟倩超，等.羊棲菜多糖降血脂作用研究[J].中國海洋藥物，2003，22(5)：27.

[3]關(guān)悅，李揚(yáng)，劉佳維.羊棲菜多糖對糖尿病腦缺血大鼠細(xì)胞凋亡的影響[J].中國海洋藥物，2013，32(2)：63-66.

[4]陸利霞，谷文英，丁霄霖.姬松茸多糖體外免疫及抗腫瘤作用初步研究藥[J].藥物生物技術(shù)，2002，9(6)：326-329.

[5]Yki-Jarvinen H.Glucosetoxicity[J].Endocr Rev,1992(13):415.

[6]Pan XR,LiG W,Hu YH,et al.Effect of diet and exercise in preventing NIDDM in people with impaired glucose tolerance:the DA Qing IGT and diabetes study[J]. Diabetes Care,1997(20):537-544.

[7]楊明正，張小如.決明子對糖尿病大鼠腎組織NF2JB活化的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，16(3)：149-150.

[8]Zhang XM.The focuses in the researches of apoptosis [J].Chin J Pharmacol. Toxicol,2000(14)：81-85.

[9]Yin XM,Ding WX.Death receptor activation-induced hepatocyte apoptosis and liver injury[J].Curr. Mol. Med,2003,3(6):491-508.

[10]Naraj NS,Anilakumar KR,Singh OV.Diallyl disufide Causes caspase-dependent apopto sis in human cancer cells through a Bax-triggered mitochondrial pathway[J].J.Nutr. Biochem,20l0,21(5):405-412.

云南香格里拉新鮮松茸大量出口日本

松茸作為世界上珍稀名貴的天然藥用菌，我國主要產(chǎn)茸區(qū)有香格里拉產(chǎn)茸區(qū)、楚雄產(chǎn)茸區(qū)和延邊產(chǎn)茸區(qū)等地區(qū)。松茸含有18種氨基酸等豐富的營養(yǎng)以及不錯的口感深受人們的喜愛。而日本人對松茸更是情有獨鐘，幾乎到了“崇拜”的地步。但是日本自產(chǎn)的松茸很少，大部分需要從中國、韓國等地進(jìn)口。據(jù)了解，今年7月份以來，共有38.4 t產(chǎn)于云南香格里拉的松茸通過南航航班從昆明經(jīng)廣州中轉(zhuǎn)至日本大阪，比去年同期增加了75%。一般松茸在保鮮的情況下可以保存7 d～10 d，昆明松茸從采摘到上市日本市場約2 d～3 d時間，較好地保存了松茸的新鮮美味。南 航預(yù)計，松茸大量出口將持續(xù)到10月份。

中國食用菌商務(wù)網(wǎng)

2014.09.02

Protective Effect ofSargassumfusiformePolysaccharide Combined withAgaricusblazeiMurill Polysaccharide on Pancreatic Beta Cells

ZHANG Jie1, YANG Xu-dong1, SHEN Mei-shu1, SONG Gao-chen1, WANG Gui-yun1,SHI Jie1, TIAN Li-mei1, YANG Jiao-xia2, ZHAN Bi-xun3

(1.Mudanjiang Medical College, MudanjiangHeilongjiang157011; 2.Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College, MudanjiangHeilongjiang157011; 3.Mudanjiang Thromboembolism Hospital, MudanjiangHeilongjiang157011)

The protective effect and mechanism of SFPS and ABP on pancreatic beta cells in high glucose were studied. Pancreatic βTc3 cells were randomly divided into model group, SFPS group, ABP group,SFPS+ABP group, and normal control group. The cells proliferation by MTT and cell apoptosis of βTc3 cells by fluorescence microscope were observed. The levels of caspase-3 gene expression in all groups by RT-PCR were detected . SFPS and ABP were inhibiting proliferation inhibition rate of βTc3 cells, and reducing apoptosis of βTc3 cells. SFPS and ABP could effectively decrease the apoptotic rate of βTc3 cells and the level of bax and caspase-3 gene expression. And the effect was more obviously in SFPS+ABP, it could effectively decrease the apoptotic rate of βTc3 cells probably through regulating bax and caspase-3 gene expression.

Sargassumfusiformepolysaccharide;AgaricusblazeiMurill polysaccharide; Pancreatic cell; Apoptosis;βTc3 cells

*項目來源：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目“羊棲菜多糖對2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞保護(hù)作用及其機(jī)制研究”(12531744)。

張杰(1977-)，女，講師，主要從事中藥的藥理與毒理研究。

**通信作者： 楊旭東，副教授。E-mail:xingzhe01mdj@126.com

2014-07-29

S646.9

A

1003-8310(2014)05-0037-03