北冬蟲夏草優(yōu)良菌株選育

玄永男，劉美善，崔林虎，高曄華，趙 麗

(延邊林業(yè)科學(xué)院，吉林 延邊 133001)

北冬蟲夏草優(yōu)良菌株選育

玄永男，劉美善，崔林虎，高曄華，趙 麗

(延邊林業(yè)科學(xué)院，吉林 延邊 133001)

本試驗(yàn)篩選出優(yōu)良的北冬蟲夏草菌株LKA，其菌絲滿皿時間短，菌絲長勢粗壯，子座分布均勻，生長速度快，生物學(xué)效率達(dá)到63.65%，其蟲草素含量為野生冬蟲夏草的613.5倍。

北冬蟲夏草；栽培技術(shù)；有效成分

北冬蟲夏草Cordycpsmilitaris(L.)Link,又名蛹蟲草，屬真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬的模式種，與冬蟲夏草同屬異種[1]。蛹蟲草的化學(xué)成分和藥理活性研究結(jié)果表明，其子座除了富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及鈣、錳、鋅、硒等微量元素外，還含有蟲草素、蟲草酸、過氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物質(zhì)。性平，味甘，具有抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)免疫和性功能等作用，可殺滅喉癌細(xì)胞，能補(bǔ)肺益腎壯陽，有扶虛損、益精氣、止血、化痰、鎮(zhèn)靜、免疫等多種功效[2-5]。

目前，野生蛹蟲草為國家采集收購品種，但資源極為稀少，而市場價(jià)格又甚為昂貴。北冬蟲夏草菌種特性不穩(wěn)定，在繼代培養(yǎng)及栽培過程中容易發(fā)生菌種退化，出現(xiàn)子實(shí)體生長不整齊，產(chǎn)生畸形等，因此其育種工作一直是北冬蟲夏草研究過程中國內(nèi)外共同關(guān)注的課題。有關(guān)菌種選育方面研究，國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較多，目前已篩選出多個蟲草素含量高的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株[6，7]。

本試驗(yàn)從野生北冬蟲夏草中分離得到純培養(yǎng)的菌種，經(jīng)過初步篩選后，將獲得的優(yōu)良菌種進(jìn)行有效成分分析，并與野生冬蟲夏草進(jìn)行比較，得到適合工廠化生產(chǎn)的北冬蟲夏草菌株, 為進(jìn)一步進(jìn)行北冬蟲夏草工廠化提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在作物生長旺盛、雨量充沛的5月至11月，先后在長白山地區(qū)的安圖縣、和龍市、撫松縣、靖宇縣、通化市、白山市等不同海拔的林區(qū)內(nèi)，采集野生北冬蟲夏草作為試驗(yàn)材料。

1.2 培養(yǎng)基質(zhì)

1.2.1 母種培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，加水至 1 000 mL，pH自然。

1.2.2 液體菌種培養(yǎng)基

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，加水至 1 000 mL，pH自然。

1.2.3 栽培培養(yǎng)基

桑蠶蛹培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 北冬蟲夏草菌種分離及初步篩選

選取生長良好，外形健壯且尚未有孢子彈射的野生北冬蟲夏草子座，切取大小5 mm左右，將組織表面用清水清洗，用0.1%～0.2%升汞水消毒處理1 min～2 min，使用無菌水沖洗2次，之后接種于PDA培養(yǎng)基中，25℃光培養(yǎng)，待組織塊長出菌絲無污染即為純菌種。每個處理10次重復(fù)，從接種后第5天開始定時觀察記錄，根據(jù)菌絲生長速度、長勢、整齊度、感染雜菌程度等指標(biāo)進(jìn)行菌種初步篩選，并使用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。

1.3.2 北冬蟲夏草栽培試驗(yàn)

將經(jīng)過初步篩選的菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基中，靜置24 h后，25℃震蕩培養(yǎng)，獲得北冬蟲夏草液體菌種。將桑蠶蛹按照每瓶120 g的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行裝瓶，高壓滅菌后每瓶接入液體菌種5 mL，每個處理10次重復(fù)，比較其雜菌感染率、子座生長情況及生物學(xué)效率。

1.3.3 北冬蟲夏草有效成分含量檢測

將篩選出的北冬蟲夏草菌株經(jīng)栽培試驗(yàn)后，進(jìn)行有效成分含量測定，并將其成分與野生冬蟲夏草有效成分進(jìn)行比較，具體測定方法：蟲草素、蟲草酸、腺苷含量測定參照中國藥典第106頁試驗(yàn)方法；蟲草多糖測定采用苯酚-硫酸法；超氧化物歧化酶活性測定參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GBT 5 009.171-2003。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的處理、相關(guān)性分析及圖表，采用 Excel 軟件處理，方差分析采用 SPSS12.0軟件處理，應(yīng)用Duncan單因素方差分析比較各處理之間的差異顯著性(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生資源采集

從各不同地區(qū)采集到不同寄主的野生北冬蟲夏草菌株，具體生長狀況如圖1所示。

2.2 不同北冬蟲夏草菌株菌種分離

將不同的野生北冬蟲夏草菌株進(jìn)行組織分離后，獲得純培養(yǎng)的菌種，從中選取生長狀況良好的菌株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，篩選出優(yōu)良菌種。

從中將菌絲生長整齊，長勢良好的菌種篩選出作為試驗(yàn)材料進(jìn)行菌株的穩(wěn)定性試驗(yàn)，并將其分別命名為YA、LKA、EA，其菌絲生長情況比較見表1和表2。

表1 北冬蟲夏草優(yōu)良菌種菌絲生長狀況比較

表2 北冬蟲夏草優(yōu)良菌種菌絲生長速度比較

注：小寫英文字母表示p<0.05水平上的差異顯著性,大寫英文字母表示p<0.01水平上的差異顯著性。

由表1及表2可見，不同菌株菌絲生長情況存在差異，LKA菌絲為橙黃色，而其余2個菌株菌絲均為淺黃色，并且LKA菌株菌絲長勢粗壯，邊緣整齊，無拮抗帶產(chǎn)生，18 d時菌絲長滿培養(yǎng)皿，菌絲生長速度顯著優(yōu)于其余2個菌株。具體生長情況如圖2所示。

2.3 北冬蟲夏草優(yōu)良菌種栽培比較

接種45 d后，各菌株子座形成情況見表3和圖3。

表3 不同北冬蟲夏草菌株子座形成情況比較

注：小寫英文字母表示p<0.05水平上的差異顯著性。

由表3、圖3可見，試驗(yàn)菌株均有子座產(chǎn)生，且均為橙黃色，但其子座產(chǎn)生數(shù)量及品質(zhì)存在差異。菌株EA有畸形子座產(chǎn)生，并出現(xiàn)子座膨大生長受限情況，子座粗細(xì)、高度不均，生長緩慢；YA菌株產(chǎn)生的子座粗細(xì)不均勻，相比之下，LKA子座生長速度最快，子座粗細(xì)均勻，且子座鮮重及干重均顯著高于其余2個菌株，生物學(xué)效率達(dá)到63.65%。

2.4 北冬蟲夏草菌株與野生冬蟲夏草有效成分含量比較

北冬蟲夏草與野生冬蟲夏草主要活性成分比較見表4。

表4 北冬蟲夏草與野生冬蟲夏草主要活性成分比較

如表4所示，通過活性成分分析，試驗(yàn)生產(chǎn)的北冬蟲夏草菌株LKA子座中蟲草素含量為野生冬蟲夏草的613.5倍，腺苷和麥角甾醇含量分別為野生北冬蟲夏草的1.47倍和12.22倍，蟲草酸和蟲草多糖含量低于野生冬蟲夏草，分別為野生冬蟲夏草的0.33倍和0.54倍，且超氧化物歧化酶活性僅在北冬蟲夏草中檢測得到。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選育的菌株LKA菌絲滿皿時間短，菌絲長勢粗壯，栽培試驗(yàn)過程中，菌株LKA子座生長速度最快，子座粗細(xì)均勻，且子座鮮重及干重均顯著高于其余2個菌株，生物學(xué)效率達(dá)到63.65%，并且其蟲草素含量為野生冬蟲夏草的613.5倍，達(dá)到908 mg100g，腺苷、麥角甾醇及超氧化物歧化酶活性也均高于北冬蟲夏草。

[1]李昊，吳白昌，李春蘭. 蟲草人工栽培與深度開發(fā)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2003：3-5.

[2]匡彥德，王美英，錢琴芳，等. 冬蟲夏草免疫增強(qiáng)作用機(jī)理的研究[J].上海免疫學(xué)雜志，1989，9(1)：6-8.

[3]劉風(fēng)安，鄭效. 蠶蛹蟲草與冬蟲夏草抗癌作用對比研究[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，21(1)：39-40.

[4]李紹平，季暉，李萍，等. 冬蟲夏草抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32(4)：373-375.

[5]徐錦堂. 中國藥用真菌學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)，1997：394-401.

[6]Das SK, Masuda M, Hatashita M, et al. A new approach for improving cordycepin productivity in surface liquidculture ofCordycepsmilitarisusing high-energy ion beam irradiation[J].Letters in Applied Microbiology，2008(47)：534-538.

[7]康麗娜. 野生與人工栽培蛹蟲草主要成分對比分析[J].新農(nóng)業(yè)，2013(3)：48-49.

Selection and Breeding on Fine Strains ofCordycepsmilitaris

XUAN Yong-nan, LIU Mei-shan, CUI Lin-hu, GAO Ye-hua, ZHAO Li

(Yanbian Academy of Forestry, YanbianJilin133001)

Fine stains ofCordycepsmilitariswere selected, the time of mycelium covering the culture dish was in a short time, and the mycelium were vigorous. The stroma had a fast growth rate and well distributed, and biological efficiency reached 63.65%. The content of cordycepin was 613.5 times higher than that of wildCordycepssinensis.

Cordycepsmilitaris; Culture technology; Effective components

玄永男(1965-)，男，正高級工程師，主要從事森林生態(tài)學(xué)研究。E-mail:yblkyxyn0701@sina.com

2014-07-10

S646.9

A

1003-8310(2014)05-0017-03