實時定量PCR 技術(shù)檢測BCR-ABL 水平在異基因造血干細胞移植治療慢性粒細胞白血病中的應(yīng)用

馮術(shù)青 宋旭東 高峰 李曉宇

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種累及造血干細胞的惡性骨髓增生性疾病，其細胞遺傳學特征為可檢出費城染色體，分子生物學特點為可檢出BCR-ABL 融合基因［1］。CML 患者的BCR-ABL 融合基因重排及其異常表達可影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致粒細胞凋亡障礙，在CML發(fā)病過程中扮演重要角色［2-3］。BCR-ABL 的表達水平反映了患者體內(nèi)白血病細胞的負荷量［4］。因此，精確檢測BCR-ABL 水平，對CML 的臨床分型診斷、個體化治療方案的制定、治療效果監(jiān)測、緩解后復(fù)發(fā)風險的評估、治療后殘留白血病細胞的檢測以及早期干預(yù)治療等方面具有重要的指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

研究納入河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院血液科2005 年5 月至2013 年5 月接受異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)治療的CML 患者15 例。其中，男性13 例，女性2 例，中位年齡32 歲(10 ～46 歲)。慢性期患者8 例，加速期患者3 例，急變期患者4 例?；颊咭话闩R床資料見表1，急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)分級按照美國Fred Hutchinson 癌癥研究所標準分為Ⅰ～Ⅳ級［2］。慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease，cGVHD)按照Sullivan 文獻標準分為局限型與廣泛型［5］。隨訪截止時間2014 年3 月，中位隨訪時間41 個月(2 ～101 個月)。

1.2 方 法

1.2.1 標本采集

分別在治療前和治療后1，2，3，6，12 個月采集15 例CML 患者骨髓血2 ～4 mL(其中1 例患者接受allo-HSCT 治療后第2 個月死亡，故未在后續(xù)時間點采集)，骨髓血標本放入抗凝真空采血管中迅速混勻，4 ℃儲存，24 h 內(nèi)檢測。

表1 15 例CML 患者一般臨床資料

1.2.2 實時定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測BCR-ABL 水平

Trizol 試劑(美國Invitrogen 公司)提取標本總RNA，相關(guān)引物序列及探針選擇按照Beillard 等［6］報道的方法設(shè)計并合成。按照秦亞溱等［7］報道的方案在ABI Prism 7500 PCR 系統(tǒng)(美國ABI 公司)中進行BCR-ABL mRNA 檢測。根據(jù)標準曲線分別計算標本中ABL 及BCR-ABL 的拷貝數(shù)，如果ABL 拷貝數(shù)≥3 ×104，即認為該標本合格。按照公式計算BCR-ABL 水平:BCR-ABL 水平(%)= (BCR-ABL拷貝數(shù)/ABL 拷貝數(shù))×100%

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差)表示。兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同分期CML 患者allo-HSCT 前、后的BCR-ABL水平

檢測8 例慢性期及7 例進展期(加速期+急變期)CML 患者在allo-HSCT 前、后不同時間點的BCR-ABL 水平發(fā)現(xiàn)，慢性期及進展期患者在allo-HSCT 前 平 均BCR-ABL 水 平 分 別 為(10. 120 ±6.035)%及(43.750 ±14.173)%，差異具有統(tǒng)計學意義(t= －2.289，P ＜0.05)。allo-HSCT 后第1，2，3，6，12 個月，慢性期與進展期患者平均BCR-ABL水平分別比較，差異均無統(tǒng)計學意義(t = －1.936，－ 2. 003，－ 0. 687，－ 1. 613 和－1.171，P 均＞0.05)。慢性期與進展期患者治療組內(nèi)各時間點的平均BCR-ABL 水平具有統(tǒng)計學差異(F =2.645 和4.591，P ＜0.05)。allo-HSCT 后12 個月，8 例慢性期患者的BCR-ABL 水平均為0，7 例進展期患者中有5 例為0。詳見表2。15 例患者總體生存12 例，死亡3 例。其中，慢性期患者存活7 例，死亡1 例;進展期患者存活5 例，死亡2 例。

表2 不同分期CML 患者allo-HSCT 前、后不同時間點BCR-ABL 水平(%，ˉx±s)

注:CML.慢性粒細胞白血病;allo-HSCT.異基因造血干細胞移植

2.2 CML 患者allo-HSCT 后早期干預(yù)性治療情況

15 例CML 患者中，6 例慢性期患者及1 例加速期患者allo-HSCT 后BCR-ABL 水平持續(xù)下降，于術(shù)后3 個月時降至0，故未行干預(yù)治療。除1 例慢性期患者于allo-HSCT 后4 個月因肺部真菌感染死亡外，其余6 例未接受干預(yù)治療的患者在隨訪截止時均無病生存。此外，1 例急變期CML 患者在allo-HSCT 后2 個月死于aGVHD(胃腸型)，故未接受復(fù)發(fā)評估和干預(yù)治療。

allo-HSCT 后出現(xiàn)BCR-ABL 水平升高或者下降緩慢者，被認為具有高復(fù)發(fā)風險，應(yīng)實施早期干預(yù)性治療。按此標準，共7 例CML 患者(慢性期患者2 例，進展期患者5 例)接受早期干預(yù)性治療，詳見表3。對于在allo-HSCT 后3 個月內(nèi)出現(xiàn)BCR-ABL水平高表達或呈進行性升高的患者，給予單純口服伊馬替尼;對于3 個月后出現(xiàn)以上情況或單純口服伊馬替尼治療效果欠佳者，則采用減少或停用免疫抑制劑的干預(yù)手段。接受早期干預(yù)性治療的患者均未出現(xiàn)aGVHD、cGVHD 以及重度骨髓抑制等不良反應(yīng)。除1 例急變期CML 患者在allo-HSCT 后12 個月復(fù)發(fā)，行再次移植無效而死亡外，其余6 例接受早期干預(yù)性治療的患者均達完全分子生物學緩解，至隨訪截止時均無病存活。

表3 7 例CML 患者allo-HSCT 后早期干預(yù)治療情況

3 討 論

qRT-PCR 技術(shù)于1996 年由美國Applied Biosystems公司推出，是一種將常規(guī)PCR 與探針雜交技術(shù)融為一體的新型核酸定量技術(shù)。qRT-PCR 工作原理是在PCR 擴增時加入1 個特異性的熒光探針，每擴增1 條DNA 鏈，就有1 個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR 產(chǎn)物形成完全同步［8］。目前應(yīng)用最廣泛的探針是Taqman 探針。TaqMan 探針法簡單易行、特異性強、假陽性率低、線性關(guān)系好，已被應(yīng)用于病原體測定、腫瘤基因檢測、基因表達、突變和多態(tài)性研究等多個領(lǐng)域［6］。qRT-PCR 實現(xiàn)了核酸檢測從定性到定量的飛躍，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快以及全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，適用于CML 治療后微小殘留病灶(minimal residual disease，MRD)的監(jiān)測［9］。

MRD 定義為:CML 患者初診時，體內(nèi)白血病細胞的數(shù)量約為1 ×1012個，經(jīng)過治療達到完全緩解后，體內(nèi)殘留有1 ×106～1 ×108個白血病細胞，是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的最根本原因［10］。所以，在CML 患者治療過程中及完全緩解后精確監(jiān)測MRD，對選擇強化治療時機、化療強度和維持治療的時間以及判斷預(yù)后、早期干預(yù)性治療等方面都具有重要意義，并且能夠極大地提高CML 患者的緩解率及長期無病生存期。

初診CML 患者往往在3 ～5 年慢性期后進入加速期乃至急變期，此時常伴有BCR-ABL 水平的上升，因此疾病進程中監(jiān)測該基因具有重要作用［11］。國內(nèi)外許多學者應(yīng)用qRT-PCR 對BCR-ABL 水平進行定量測定，探討B(tài)CR-ABL 水平與CML 進展的關(guān)系，及其在預(yù)后判斷和動態(tài)監(jiān)測MRD 中的作用。呂曉東等［12］應(yīng)用qRT-PCR 檢測324 例CML 患者518 份標本的BCR-ABL 表達情況，發(fā)現(xiàn)從慢性期進入加速期和急變期CML 患者的BCR-ABL 逐漸增高，分別為12.6%，25.4%和57.2%(P ＜0.05);治療后患者BCR-ABL 水平隨時間延長逐漸降低，一般在6 個月后降至0。本研究結(jié)果顯示相比進展期CML 患者，慢性期CML 患者在allo-HSCT 前BCRABL 水平較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);同時發(fā)現(xiàn)，allo-HSCT 治療后發(fā)生分子生物學緩解的患者BCR-ABL 定量結(jié)果持續(xù)下降，與國內(nèi)外文獻報道類似［13-15］。

有學者均認為allo-HSCT 后3 ～5 個月可通過qRT-PCR 檢測BCR-ABL 水平預(yù)測白血病復(fù)發(fā)［16］，但該法能否預(yù)測MRD 的發(fā)生一直存在爭議。Hagop 等［17］發(fā)現(xiàn)CML 患者BCR-ABL 水平呈增加趨勢或持續(xù)高水平可預(yù)示復(fù)發(fā)。Elmaagacli 等［18］發(fā)現(xiàn)，BCR-ABL 水平在CML 的不同分期有顯著差異。秦亞溱等［7］報道治療后各時間段均有一定數(shù)量的CML 患者可檢測出BCR-ABL。許蘭平等［19］認為BCR-ABL 水平具有以下特點的CML 患者復(fù)發(fā)風險較低:(1)allo-HSCT 治療后1 個月內(nèi)較治療前下降至少2 個對數(shù)級以上;(2)allo-HSCT 治療后2 ～3 個月內(nèi)持續(xù)下降或保持在低水平;(3)allo-HSCT治療后4 ～6 個月內(nèi)降低，直至檢測不出。本研究中，6 例慢性期CML 患者及1 例加速期CML 患者的BCR-ABL 水平在allo-HSCT 治療后1 ～3 個月內(nèi)持續(xù)下降，并于3 個月以后持續(xù)為0，故均未行早期干預(yù)性治療，臨床上也無復(fù)發(fā)，患者均長期存活。該結(jié)果提示僅檢測治療后3 個月的BCR-ABL 水平臨床意義不大，這與Heaney 等［20］報道相一致。因此，通過qRT-PCR 動態(tài)檢測CML 患者allo-HSCT 治療后的BCR-ABL 水平有助于篩選出無需進行復(fù)發(fā)干預(yù)的患者，可使復(fù)發(fā)干預(yù)更具針對性，從而提高CML 患者無病生存率。

CML 患者治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或復(fù)發(fā)風險的干預(yù)治療措施包括減少或停用免疫抑制劑，以及采用以伊馬替尼為代表的酪氨酸激酶抑制劑。減少或停用免疫抑制劑可以使復(fù)發(fā)患者達到持久的分子生物學緩解，可使70% ～80%的慢性期患者獲得持久療效，而對進展期CML 患者有效率則很低，早期應(yīng)用往往伴隨骨髓抑制和嚴重的移植物抗宿主?。?1］。伊馬替尼短期療效顯著，但早期應(yīng)用的安全性以及停藥后是否能使患者繼續(xù)保持分子生物學緩解還存在爭議［22］。許蘭平等［23］分析64 例接受allo-HSCT的CML 患者資料，根據(jù)BCR-ABL 檢測結(jié)果在治療后進行了早期干預(yù)性治療，方案為免疫調(diào)節(jié)、單獨使用伊馬替尼及免疫調(diào)節(jié)與伊馬替尼聯(lián)合使用。結(jié)果顯示，3 種方案可以達到相似的療效，但不良反應(yīng)不同，應(yīng)權(quán)衡并進行個性化選擇。

綜合本研究結(jié)果，我們認為qRT-PCR 動態(tài)檢測BCR-ABL 水平可及時、準確地預(yù)知CML 患者疾病狀態(tài)。allo-HSCT 治療后前3 個月，由于患者的造血及免疫功能未得到穩(wěn)定重建，應(yīng)盡量采用藥物而非免疫調(diào)節(jié)控制疾病復(fù)發(fā)。但藥物僅在短期有較好作用，長期療效需要在患者達到造血及免疫功能穩(wěn)定重建后采用免疫調(diào)節(jié)手段，可有效減少相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，進一步提高患者的長期生存率。由于本研究病例數(shù)較少，尚需擴大樣本量以更好地完善CML患者接受allo-HSCT 治療后的早期干預(yù)性治療體系，以進一步提高患者無病生存率。

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